MicroRNAs治療肝癌的方法及相關(guān)肝癌模型的研究進(jìn)展

戴列軍 黃新造 費(fèi)新應(yīng)

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中醫(yī)醫(yī)院(市傳染病醫(yī)院)肝病科 (湖北 黃石，435000)

微小RNA(MicroRNAs)由長度大約為20～24個(gè)核苷酸構(gòu)成，其主要功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。過去十多年中的研究表明它們在肝癌發(fā)生中起重要的作用。因此，它們已經(jīng)成為治療肝癌潛在的分子和靶標(biāo)。微小RNA很容易通過全身給藥的方法作用于肝臟，因此，肝癌是測試MicroRNAs治療方法的優(yōu)秀平臺(tái)。近年來，人們廣泛開展了MicroRNAs治療肝細(xì)胞癌(HCC)的研究，并且建立了這方面的動(dòng)物模型。這些研究為評(píng)估MicroRNAs或抗MicroRNAs的治療打下了良好基礎(chǔ)。總的來說，MicroRNAs的抗腫瘤活性已得到證實(shí)，由于沒有副作用或僅有輕微的副作用，MicroRNAs的預(yù)防性使用也很值得期待。

1 基于MicroRNAs的治療方法

通過對人類和鼠的全基因表達(dá)模式對比分析表明，許多小鼠模型可以重現(xiàn)人類病情中觀察到的關(guān)鍵生物和分子事件。因此，小鼠模型被廣泛用于測試潛在的治療靶點(diǎn)，也用于臨床前研究[1]。近年來，人們通過抑制MicroRNAs表達(dá)或MicroRNAs替換的方法來治療和預(yù)防HCC。

1.1 MicroRNAs抑制療法 Krutzfeldt及其同事首先表明，使用特定分子可以有效地使MicroRNAs保持沉默，通過靜脈使用化學(xué)修飾單鏈RNA(antagoMicroRNA)能夠 特異性抑制肝臟MicroRNA-122表達(dá)。antago MicroRNAs是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的MicroRNAs拮抗劑，通過與體內(nèi)成熟MicroRNAs競爭性結(jié)合，阻止MicroRNAs與其靶基因mRNA的互補(bǔ)配對，抑制MicroRNAs發(fā)揮作用。研究者在非人類靈長動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)了基因沉默療法的安全性，沒有發(fā)現(xiàn)其肝毒性的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)行了許多關(guān)于MicroRNAs抑制的研究。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MicroRNA-221具有促進(jìn)HCC的作用，在一項(xiàng)可重復(fù)性研究中，全身給予膽固醇標(biāo)記的抗MicroRNA-221分子具有減少原位肝癌細(xì)胞增殖的作用，并延長患者的生存期[2]。另一項(xiàng)關(guān)于MicroRNA-221的研究發(fā)現(xiàn)在TG221轉(zhuǎn)基因鼠模型中，抗MicroRNA-221寡核苷酸表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，經(jīng)組織病理學(xué)分析證實(shí)被治療小鼠的腫瘤數(shù)目和大小顯著減少。接受抗MicroRNA-221治療的小鼠肝組織中MicroRNA-221水平顯著下降，從而證實(shí)這些分子具有抑制內(nèi)源性MicroRNA-221的能力(見表1)。Lim等人的工作支持通過調(diào)節(jié)MicroRNAs水平來治療肝癌[3]。其中，抑制MicroRNA-494表達(dá)(在人類HCC中MicroRNAs過度表達(dá))可以顯著減少M(fèi)YC肝癌模型的腫瘤大小。

表1 基于MicroRNAs的HCC治療方法

丙型肝炎病毒(HCV)感染慢性化后可發(fā)展為肝硬化，進(jìn)一步可發(fā)展為HCC。研究者發(fā)現(xiàn)MicroRNA-122具有促進(jìn)HCV復(fù)制的作用[4]。相應(yīng)地，與MicroRNA-122序列互補(bǔ)的LNA分子可以抑制非人類靈長動(dòng)物HCV病毒的復(fù)制。這些結(jié)果支持把MicroRNA-122作為抗病毒治療潛在靶標(biāo)[5]。目前研究者正在評(píng)估抗MicroRNA-122寡核苷酸“MicroRNAavirsen SPC3649”(Santaris Pharma)治療HCV感染的作用，已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

1.2 MicroRNAs替代療法 MicroRNAs替代是另一種可以用來揭示MicroRNAs功能的方法，可以證實(shí)MicroRNAs在腫瘤發(fā)生中的作用，并為治療癌癥提供輔助手段。其中的一種方法是恢復(fù)癌細(xì)胞下調(diào)表達(dá)的MicroRNAs水平。通常使用荷瘤小鼠模型來測試MicroRNAs的抑瘤活性，由腺病毒(AAV)遞送的一些納米級(jí)大小的脂質(zhì)顆粒或膽固醇偶聯(lián)修飾的寡核苷酸(見表2)。Hou等利用膽固醇偶聯(lián)的小RNA和AAV遞送系統(tǒng)，有效地恢復(fù)HCC裸鼠肝組織中的MicroRNA-199a/b-3p表達(dá)，抑制腫瘤生長，且沒有發(fā)現(xiàn)其肝毒性證據(jù)。慢病毒(Lentivirus)介導(dǎo)的MicroRNA-199a也能夠抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長[6]，證實(shí)該MicroRNAs的抗癌作用及其臨床應(yīng)用潛力。

為了建立更好的人類肝癌模型，研究者使用基因工程或化學(xué)誘導(dǎo)方法建立了多種小鼠肝癌模型。采用MYC誘導(dǎo)建立的小鼠HCC模型，研究者證實(shí)了MicroRNA-26a26和MicroRNA-122[7]的抑瘤活性。在二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的小鼠HCC模型中，靜脈給予MicroRNA-124后，腫瘤生長受到抑制，其抑瘤作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制包含肝細(xì)胞核因子4α(HNF4a)的MicroRNAs /炎癥信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[8]。這些研究表明，MicroRNAs類似物在治療癌癥上表現(xiàn)出良好的前途，可以應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。MRX34(MicroRNAs Therapeutics Inc.)是第一個(gè)MicroRNAs類似物藥物，它是一種脂質(zhì)體配方的腫瘤抑制劑miR-34a的模擬物，已經(jīng)進(jìn)入多中心 I期臨床試驗(yàn)，旨在評(píng)估其治療原發(fā)性肝癌或其他肝轉(zhuǎn)移腫瘤的安全性(臨床試驗(yàn)注冊號(hào)：NCT01829971)[9]。

1.3 溶瘤病毒療法 溶瘤病毒是一類具有復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，作用于腫瘤組織，導(dǎo)致癌細(xì)胞溶解，而對正常組織僅表現(xiàn)出輕微的毒性。因此，溶瘤病毒療法是比較有希望的治療癌癥的方法[10，11]。溶瘤病毒能與HCC中表達(dá)的MicroRNAs相互作用，由于腫瘤組織與正常組織MicroRNAs表達(dá)存在差異，研究者利用這一點(diǎn)提高基于溶瘤病毒療法的安全性。例如，為了克服靜脈使用溶瘤腺病毒的肝毒性，可以將調(diào)節(jié)性MicroRNA122序列插入到腫瘤特異的增殖型腺病毒(CRAd)基因組中，該病毒不能在正常肝組織復(fù)制，但在腫瘤組織中具有復(fù)制能力[12]。溶瘤病毒還可以應(yīng)用于HCC異種移植模型中，有研究者構(gòu)組建一種let-7依賴性腺病毒，使它只能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而不能在正常肝細(xì)胞中復(fù)制[13]。此外，MicroRNA-199依賴性腫瘤特異性腺病毒也可以在HCC中細(xì)胞復(fù)制，在正常肝細(xì)胞中不復(fù)制。這種病毒既能夠抑制裸鼠皮下異種移植腫瘤的生長，也能夠抑制免疫健全小鼠中HCC細(xì)胞生長，而且沒有顯著的肝毒性[14](見表1)。

2 肝癌的MicroRNAs特異性動(dòng)物模型

通過對動(dòng)物模型的MicroRNAs基因進(jìn)行修飾來證明MicroRNAs參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展，有研究者觀察到MicroRNAs在細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)展中的重要作用，這些模型提供了體內(nèi)測試MicroRNAs功效的平臺(tái)(見表2)。

表2 研究MicroRNAs治療肝癌的動(dòng)物模型

研究者已經(jīng)使用了抑癌基因、致癌基因、乙型肝炎病毒或HCV病毒基因開發(fā)小鼠肝癌模型[3]，近來有研究報(bào)道了基于MicroRNAs的小鼠肝癌模型。TG222小鼠是第一種通過MicroRNAs過度表達(dá)誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[15]有研究者構(gòu)建了肝臟MicroRNA-221過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型經(jīng)小鼠中雄性動(dòng)物表現(xiàn)出強(qiáng)烈HCC易患性，隨著年齡增長或者經(jīng)DEN處理后，模型小鼠自發(fā)出現(xiàn)結(jié)節(jié)性肝臟病變和腫瘤。HCC組織中一些MicroRNAs表達(dá)下降，因此研究者構(gòu)建了MicroRNA-122基因敲除的小鼠模型，模型小鼠表現(xiàn)出肝炎、纖維化現(xiàn)象，隨著年齡增長還可以自發(fā)出現(xiàn)肝腫瘤。這些研究證實(shí)MicroRNA-122對肝臟腫瘤的抑制功能，以及其在肝臟代謝和肝細(xì)胞分化中的重要性[7,16]。

除了研究這些MicroRNAs特異性模型外，有研究者注意到減少M(fèi)icroRNAs組件的重要性。比如，DDX20是一種含有MicroRNAs組件的核糖核蛋白復(fù)合物，它通過抑制NF-κB活性來調(diào)節(jié)MicroRNA-140功能[17]，經(jīng)DEN處理后，MicroRNA-140基因敲除小鼠容易發(fā)展為HCC，具有類似于DDX20功能缺陷表型。這表明MicroRNA-140可以通過調(diào)節(jié)NF-κB通路成為腫瘤抑制因子[18]，進(jìn)而證實(shí)MicroRNAs在肝癌調(diào)控中的重要性。

3 討論

肝細(xì)胞癌是最常見的肝癌類型，目前治療方案取決于腫瘤大小和分期。對于晚期、不可切除的HCC患者，目前有效的方法是使用多激酶抑制劑——索拉非尼。該藥物通過靶向作用于酪氨酸激酶受體(VEGFR和PDGFR)以及絲氨酸-蘇氨酸激酶(c-RAF和BRAF)，Ⅲ期實(shí)驗(yàn)證明索拉非尼能延長HCC患者的中位生存期和無進(jìn)展生存期[19]。然而，臨床上仍然需要更有效且無毒副作用的治療方法。MicroRNAs或抗MicroRNAs作為腫瘤治療分子引起了廣泛的關(guān)注。目前，盡管它們的抗癌有效性仍有待完全證實(shí)，它們的短期安全性得到了證實(shí)，未來研究要側(cè)重于使用MicroRNAs /抗MicroRNAs寡核苷酸治療HCC，為此建立的HCC動(dòng)物模型是檢測MicroRNAs /抗MicroRNAs分子有效性的重要平臺(tái)。