牛蒡子苷元對子宮內膜癌HEC1B細胞的增殖抑制作用及機制

劉若男　劉文靜　邱建閣

摘要目的：探討牛蒡子苷元（ARG）對子宮內膜癌HEC1B細胞的增殖抑制作用及機制。方法：HEC1B細胞分為觀察組和對照組，觀察組用終濃度為10、20、30、40、60、100 μmol/L的ARG干預，對照組用05%二甲基亞砜（DMSO）干預。48 h后，用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期；蛋白免疫印跡法（WB）檢測細胞NFκB信號通路相關蛋白表達。結果：10、20、30、40、60、100 μmol/L ARG干預48 h，HEC1B細胞的相對生存率分別為（9236±052）%、（8959±074）%、（7849±068）%、（5647±059）%、（4012±069）%、（3752±058）%，且隨著ARG作用濃度的升高，HEC1B細胞的相對生存率呈逐漸降低趨勢，差異有統計學意義（P<005），干預48 h HEC1B細胞50%抑制濃度（IC50）為50 μmol/L。對照組和觀察組（50 μmol/L ARG）細胞凋亡率分別為（289±056）%、（2658±326）%，觀察組細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<005）。但觀察組細胞周期分布與對照組比較，差異無統計學意義（P>005）。觀察組（50 μmol/L ARG）細胞p65、pIκBα蛋白表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<005），2組間IκBα蛋白表達量差異無統計學意義（P>005）。結論：ARG可抑制HEC1B細胞增殖，促進其凋亡，其作用機制與可能與降低NFκB通路相關蛋白表達水平，抑制NFκB通路活化有關。

關鍵詞子宮內膜癌；牛蒡子苷元；HEC1B細胞；增殖；凋亡；NFκB通路

Proliferation Inhibition Effect of Arctigenin on Endometrial Carcinoma HEC1B Cell and Its Mechanism

Liu Ruonan1，Liu Wenjing1，Qiu Jiange2，Luo Suiyu3

（1 Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008，China； 2 Cell Signal Transduction and Proteomics Research Center，The Academy of Medical Science，ChinaZhengzhou University，Zhengzhou 450008，China； 3 Department of Gynecology，Henan Province People′s Hospital，Zhengzhou 450003，China）

AbstractObjective：To investigate the proliferation inhibition effect of Arctigenin （ARG） on endometrial carcinoma HEC1B cell and its mechanism.Methods：HEC1B cells were divided into test group and control group.The test group was intervened with ARG at the final concentration of 10，20，30，40，60，100 μmol/L，and the control group was intervened with 05% dimethyl sulfoxide （DMSO）48 h after incubation，the proliferation was detected by MTT assay.The cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.The expression of NFκB signaling pathway related proteins were detected by western blotting （WB）.Results：The relative survival rates of HEC1B cell intervened with 10，20，30，40，60 and 100 mol/LARG after 48 h were （9236±052）%，（8959±074）%，（7849±068）%，（5647±059）%，（4012±069）%，（3752±058）% respectively，with the increase of ARG concentration.The relative survival rates of HEC1B cells decreased gradually （P<005）50% inhibitory concentration （ID50） of HEC1B cells intervened with ARG after 48 h was 50 μmol/L.The apoptosis rates of HEC1B cells in the control group and the test group （50 μmol/L ARG） were （289±056）%，（2658±326）% respectively.The apoptosis rate in the test group was significantly higher than that in the control group （P<005）.However，there was no significant difference in cell cycle distribution between the test group and the control group （P>005）.The expression levels of p65 and pIκBα in the test group （50 μmol/L ARG） were significantly lower than that in the control group （P<005）.There was no significant difference in the expression levels of IκBα between the test group and the control group （P>005）.Conclusion：ARG can inhibit the proliferation and promote apoptosis of HEC1B cells，and its mechanism may be related to decreasing the expression level of NFκB related protein and inhibiting the activation of NFκB pathway.

Key WordsEndometrial carcinoma； Arctigenin； HEC1B cells； Proliferation； Apoptosis； NFκB pathway

中圖分類號：R2855文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.046

子宮內膜癌又稱子宮體癌，為子宮內膜腺體的惡性腫瘤，約占女性癌癥總數的7%，其發病與遺傳、患者長期使用激素以及高血壓、肥胖、糖尿病、不孕不育、絕經等體質因素有關[12]。近年來中西醫結合抗腫瘤治療取得了較為顯著的臨床效果，因此中藥及其活性成分的抗腫瘤作用研究成為廣大中醫醫務工作者關注的焦點，也成為臨床研究的熱點和方向。牛蒡子苷元（Arctigenin，ARG）為木質素類化合物，是中藥牛蒡子的主要藥理活性成分之一[3]。最新研究[45]證實，ARG不僅具有抗炎及免疫調節的功效，還具有較強的抗腫瘤作用，體外實驗顯示ARG能夠增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性，但是目前其對子宮內膜癌細胞抗腫瘤作用的研究仍較為罕見。本研究以子宮內膜癌HEC1B細胞為研究模型，觀察ARG對HEC1B細胞的增殖抑制作用，分析其抗腫瘤作用機制，現將結果報道如下。

1材料與方法

11材料

111細胞子宮內膜癌HEC1B細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

112藥品ARG：每支20 mg，批號：115711，美國Santacruz Biotechology公司；DMEM培養基、二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma公司；胎牛血清，美國Gibco公司；胰蛋白酶，杭州四季青生物試劑有限公司；Annexin VFITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，美國Thermofisher有限公司；p65和IκBα抗體，美國Santa Cruz公司；磷酸化IκBα（pIκBα）抗體，美國Cell Signaling公司等。

113儀器細胞培養板及細胞培養瓶，無錫耐思生物科技有限公司；DS425P電子天平，上海寺崗電子有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter有限公司；CKX31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；725型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；MetaMorph圖像分析系統，美國Media Cybernetics公司等。

12方法

121ARG的配制DMSO溶解ARG制成20 mmol/L的溶液，除菌后4 ℃避光暫存。

122HEC1B細胞培養及ARG干預將HEC1B細胞以含有10%胎牛血清、1×105 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，置于溫度為37 ℃，5% CO2培養箱中培養，每3天以025%的胰蛋白酶消化傳代1次。將生長至對數期HEC1B細胞用025%胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，以DMEM培養液調整細胞密度為2×104～3×104個/mL接種于培養瓶中，于37 ℃ 5% CO2條件下培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，觀察組細胞分別加入終濃度為10、20、30、40、60、100 μmol/L的ARG處理[6]，對照組則以05%DMSO處理，各組均繼續培養48 h。

13觀察指標

131MTT法檢測ARG對HEC1B細胞增殖抑制作用取上述處理48 h后的HEC1B細胞，用025%胰蛋白酶消化，以密度為4×103～5×103個/mL接種于96孔細胞培養板中，于37 ℃ 5% CO2條件下培養箱中培養。24 h后待細胞貼壁生長后，按照122的方法處理細胞，于培養箱中繼續培養48 h后進行細胞增殖活性的檢測。將各組細胞上清吸棄后加5 mg/mL的MTT，每孔20 μL，繼續培養4 h，棄上清，加DMSO，輕輕震蕩10 min，以全自動酶標儀檢測各孔于波長為570 nm的吸光光度值（OD570 nm），繪制生存曲線，細胞相對生存率=（觀察組OD570 nm/對照組OD570 nm）×100%，計算50%抑制濃度（IC50）。

132流式細胞術檢測ARG對HEC1B細胞周期及凋亡率的影響觀察組和對照組HEC1B細胞分別用50 μmol/L的ARG及05%DMSO處理，干預48 h后，按照Annexin VFITC/PI檢測試劑盒的實驗要求收集細胞并處理，于收集好的細胞沉淀中加入1×binding buffer 200 μL懸浮細胞，并加入Annexin VFITC 5 μL，4 ℃避光孵育15 min，加5 μL碘化丙啶（PI）染液混勻，室溫避光孵育5 min，以流式細胞儀進行檢測，以Modfit LT20細胞周期分析軟件分析HEC1B細胞周期分布及凋亡情況。

133蛋白免疫印跡法（WB）檢測ARG對HEC1B細胞NFκB信號通路相關蛋白表達的影響將HEC1B細胞以密度為2×104～3×104個/mL接種于細胞培養瓶，至對數期棄培養液，觀察組分別加終濃度為50 μmol/L的ARG處理，對照組則以05%DMSO處理，48 h后收集細胞。提取細胞總蛋白，以βactin為參照，MetaMorph圖像分析系統分析各組細胞p65、IκBα、pIκBα蛋白表達情況。

14統計學方法采用SPSS 220軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗法，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21ARG對HEC1B細胞的增殖抑制作用經MTT實驗檢測，10、20、30、40、60、100 μmol/L ARG處理48 h，HEC1B細胞的相對生存率分別為（9236±052）%、（8959±074）%、（7849±068）%、（5647±059）%、（4012±069）%、（3752±058）%，隨著ARG作用濃度的升高，HEC1B細胞的相對生存率呈逐漸降低趨勢，差異有統計學意義（P<005），ARG處理48 h HEC1B細胞的ID50為50 μmol/L，因此后續實驗均采用50 μmol/L的ARG進行HEC1B細胞的處理。

3討論

子宮內膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發病率居我國婦科腫瘤的第2位，而近年來其發病有年輕化的趨勢，嚴重危害女性健康。常規放化療雖可抑制癌細胞增殖，但患者對于小劑量治療易產生耐藥性，大劑量治療則由于其細胞毒性，患者易無法耐受而影響臨床治療，因而更安全有效的低毒性治療藥物成為臨床研究的熱點和方向。中醫學中并無子宮內膜腺癌的病名，據其主要臨床特點將其歸屬“崩漏”“痛經”“癥瘕”“五色帶下”等范疇，認為正氣虛弱、血瘀、氣滯、濕毒、熱邪等為子宮內膜腺癌的主要病機，屬于本虛標實之癥。患者疾病初期邪盛而正虛明顯，后期則隨疾病病情進展出現氣血陰陽虛弱，表現為肝脾腎三臟具損，而腎虛腎臟受損最甚[7]。尚洪宇[8]研究認為，長期肝腎虧虛、沖任二脈失調導致了子宮內膜癌的形成，同時也與脾虛生濕，濕蘊化熱，濕熱注于胞宮，與癒血互結化為邪毒所致有關。目前關于中醫藥抗腫瘤的相關研究報道甚多，充分反映出中藥所具有的潛在抗腫瘤作用，李柳葉等[9]研究發現，白花蛇舌草黃酮通過降低子宮內膜癌Ishikawa細胞炎性細胞因子的表達進而抑制細胞增殖。陳寒露等[10]研究發現，姜黃素通過上調抑制基因NKD2的表達，抑制Wnt信號通路進而體外抑制結腸癌細胞SW620的生長。武超等[11]研究表明，黃芪皂苷Ⅱ可增加人肝癌細胞株HepG2對5FU的敏感性，明顯抑制細胞的增殖，其機制與抑制pERK1/2表達有關。

牛蒡子為牛蒡的果實，ARG為牛蒡子的主要木脂素成分，具有不良反應小及較好的調控免疫等作用。近期報道[12]顯示，ARG具有顯著的抗腫瘤活性，其在體內外均可抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。研究[13]報道，ARG可增加非小細胞肺癌H460細胞對順鉑的敏感性，抑制細胞增殖；王靜泓等[14]研究發現，ARG可促進肝癌HepG2、Hep3B細胞的凋亡，與抑制PI3K/Akt信號通路下調抗凋亡蛋白表達有關。本研究結果顯示，ARG可抑制子宮內膜癌HEC1B細胞增殖，并呈濃度依賴性的特點，同時ARG也具有促進HEC1B細胞凋亡的作用，但對細胞周期并無明顯的影響。因此可以認為ARG可能通過誘導HEC1B細胞凋亡的方式實現其對子宮內膜癌細胞的殺傷作用。關于ARG的抗腫瘤作用機制研究報道不一，Huang等[15]發現，ARG誘導卵巢癌細胞的凋亡與i NOS/NO/STAT3/Survivin信號通路相關；Yao等[16]研究證實，ARG通過抑制STAT3信號增強多種腫瘤細胞體外對順鉑的化療敏感性；Hsieh等[17]報道，ARG誘導雌激素受體陰性的乳腺癌細胞凋亡與ROS/p38 MAPK通路有關。NFκB信號通路為炎性細胞通路，通過抑制細胞凋亡、參與腫瘤侵襲性轉移及誘導腫瘤耐藥等多種途徑參與腫瘤的形成的進展，p65是NFκB通路上的主要位點蛋白，具有調控下游基因轉錄，激活細胞因子的級聯放大作用，可反映NFκB的活化程度[18]。本研究結果中，觀察組HEC1B細胞p65、pIκBα蛋白表達量明顯低于對照組，表明ARG可抑制上游信號分子IκBα的磷酸化，抑制NFκB信號通路，進而抑制子宮膜癌HEC1B細胞的增殖，并促其凋亡。

綜上所述，ARG可抑制HEC1B細胞增殖，促進凋亡，其作用機制與可能與降低NFκB通路相關蛋白表達水平，抑制NFκB通路活化有關，但是否具有其他作用機制尚需進一步研究確認。

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（2018-04-16收稿責任編輯：張文婷）