不同霉菌混合培養(yǎng)對黃酒發(fā)酵質(zhì)量的影響

高月瀅

摘要：本實驗研究了不同霉菌混合培養(yǎng)對發(fā)酵的影響，通過對各菌種組合中霉菌的糖化能力與黃酒酵母的發(fā)酵能力進(jìn)行測定，探究出釀造黃酒的最佳糖化菌種組合。本實驗進(jìn)行了試飯?zhí)腔Φ臏y定，采用DNS比色法測定還原糖的含量，硫酸-蒽酮法測定總糖的含量，氣相色譜法測定酒精度。結(jié)果顯示，根霉+曲霉+毛霉組合的糖化力最強(qiáng)，還原糖濃度最高達(dá)到25.75g/L;根霉+曲霉+毛霉+黃酒酵母組合對酵母的發(fā)酵最有利，酒精含量最高可達(dá)3.901%。故根霉+曲霉+毛霉+黃酒酵母組合為本次實驗中黃酒糖化劑的最佳選擇。

關(guān)鍵詞：試飯法 糖化力 DNS法 硫酸-蒽酮法 還原糖

Effect of Mixed Cultivation of Different Molds on Fermentation of Rice Wine

Gao Yueying （ School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology ）

Abstract： In this experiment， the effect of mixed culture of different molds on fermentation was studied. The saccharification ability of mold and the fermentation ability of rice wine yeast were determined by the combination of various strains， and the optimal saccharification strain combination for brewing yellow wine was explored. In this experiment， the saccharification power of rice was measured in a test， the content of reducing sugar was determined by DNS colorimetry， the total sugar content was determined by sulfuric acid-anthrone method， the alcohol content was determined by gas chromatography. The results showed that the combination of Rhizopus+Aspergillus+Mucor molds had the strongest saccharifying power and the reducing sugar concentration is up to 25.75g/L;. The combination of Rhizopus+Aspergillus+Mucor+rice wine yeast strains was the most favorable for yeast fermentation， with the alcohol content can reach up to 3.901%. Therefore， the combination of Rhizopus+Aspergillus+Mucor+rice wine yeast strains is the best choice for the yellow rice wine saccharification agent in this experiment.

Key words： rice test method， saccharification force， DNS method， sulfuric acid - anthrone method， reducing sugar

黃酒是我國最古老的酒種，其獨特的糖化發(fā)酵并行工藝在世界釀造酒中獨樹一幟，加上其悠久的歷史文化底蘊(yùn)，被譽(yù)為“天下一絕”。黃酒是以玉米、稻米、小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、陳化等工藝制作成的釀造酒[1]。黃酒的質(zhì)量和風(fēng)格不僅取決于釀酒工藝，而且與所用釀酒原料和微生物密不可分。糖化劑將淀粉水解生成葡萄糖等可發(fā)酵糖，發(fā)酵菌種將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇等物質(zhì)。所以糖化發(fā)酵劑質(zhì)量優(yōu)劣直接關(guān)系到黃酒的質(zhì)量與產(chǎn)量，其地位極其重要，被稱為“酒之骨”。

糖化發(fā)酵劑為黃酒的釀造提供復(fù)合酶系，在紅曲、麥曲和小曲等酒曲的制造過程中，多種微生物的共同作用，從而產(chǎn)生多種酶系，為釀造過程中的各生化反應(yīng)提供催化劑，從而產(chǎn)生多種香味物質(zhì)。同時在酒曲的制作過程中產(chǎn)生大量的香味物質(zhì)和前體產(chǎn)物，為黃酒賦予特有的香韻，從而使黃酒的代謝物質(zhì)和香味成分大大增加。同時，這些物質(zhì)在釀造過程中被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化、代謝、融合和分解，進(jìn)而生成新的富含香氣的物質(zhì)[2]。

根霉是酒曲的主要糖化菌，酵母菌是主要發(fā)酵菌。在糖化階段，霉菌作為酒曲中的主要微生物，主要是根霉、毛霉的生長，提供豐富的微生物酶系，主要有：α-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖淀粉酶[3]。在將糖化液加水稀釋后，酵母菌才大量繁殖，醪液的酒精含量逐漸上升。在微生物發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品過程中，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶、纖維素酶、蛋白水解酶、酯化酶等發(fā)揮著重要的作用。對于黃酒生產(chǎn)來說，多菌種糖化發(fā)酵有利于提高產(chǎn)品中風(fēng)味物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

霉菌1（根霉）、霉菌2（曲霉）、霉菌3（毛霉）、黃酒酵母4 ：實驗室自篩。

1.1.2 試劑

無水乙醇、無水甲醇、酒石酸鉀鈉、重蒸酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、蒽酮、98%濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、80%濃硫酸、葡萄糖：國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

虎紅瓊脂培養(yǎng)基： 虎紅瓊脂31.6g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌20min。

1.1.4 實驗儀器及設(shè)備

Gc9790型氣相色譜儀;分光光度計;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋;G-16臺式大容量高速離心機(jī);移液管、玻璃棒等實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 試飯?zhí)腔Φ臏y定

試飯：選擇無霉變、砂石的大米，稱取40g，裝入三角瓶中，加水60g，扎上兩層封口膜（或一層封口膜加一層牛皮紙），常溫蒸煮40min，或置于滅菌鍋中，在0.05MPa下蒸煮20min，要求飯粒熟而不爛。用干凈消過毒的玻璃棒將飯粒打散，待涼至35℃時，接入等量的霉菌孢子液。30℃培養(yǎng)2 ～3 d。

取樣：取經(jīng)試飯的5g飯樣于三角瓶中，用干凈藥匙搗爛后，加入5g水浸泡0.5h，15min攪拌1次。用6層紗布或脫脂棉過濾或用離心機(jī)在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，得濾液或離心上清液。上述液體適當(dāng)稀釋后，按DNS比色法測定還原糖含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析菌種的試飯?zhí)腔ΑＴ囷執(zhí)腔κ侵妇N發(fā)酵米飯產(chǎn)生糖分的能力，按硫酸-蒽酮法測定總糖含量。

1.2.2 還原糖的測定（DNS比色法）

向試管中加入2mL待測液，然后加入3，5-二硝基水楊酸試劑1.5mL，混勻，放入沸水浴中加熱5min，取出后立即用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至25mL， 充分混勻。在分光光度計上于波長540nm處測定各管OD值。其中空白試驗中將稀釋樣液換為水[4]。

1.2.3 總可溶性糖測定（硫酸-蒽酮法）

蒽酮可以與游離的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反應(yīng)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，在620nm處有最大吸收值。

取稀釋后的待測液1mL，加入蒽酮試劑4mL（冰浴），樣品冷卻完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷卻放置10min，620nm處比色測量各管OD值。其中空白試驗中將稀釋樣液換為水。

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

取8支干燥潔凈的試管，按順序向各管中加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL，用蒸餾水將各管溶液補(bǔ)充至1mL后置于冰水浴中冷卻5min。向各管中再加入4mL蒽酮試劑，置于沸水浴中準(zhǔn)確煮沸10min，取出用流水冷卻，室溫冷卻10min，于620nm處比色測定吸光值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 酒精度的測定

酒精度的常用檢測方法分為三種，分別為密度瓶法、氣相色譜法、酒精計法。酒精計法要求樣品溶液蒸餾后進(jìn)行測定，過程煩瑣;密度瓶法操作方便，投資較少，但其測定結(jié)果存在一定的誤差;色譜儀雖然價格昂貴，但具有精確度高、靈敏度高、檢測速度快的優(yōu)點，使氣相色譜法成為測定酒度的首選方法[5]。

因此，本次實驗采用氣相色譜法對樣品的酒精度進(jìn)行測量，按參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，精密量取恒溫20℃的無水乙醇1mL、2mL、4mL、5mL、6mL、10mL，分別置于100mL容量瓶中，精密加入恒溫至20℃的正丙醇（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）各5mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液各1mL，分別置于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。取1μL注入氣相色譜儀進(jìn)行測定[5-6]。以酒精含量作為橫坐標(biāo)，乙醇峰面積作為縱坐標(biāo)，作圖得到酒精含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

2.1.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

配置一系列梯度濃度的葡萄糖溶液，采用DNS法，在540nm波長下得到相應(yīng)的吸光值，由吸光值和濃度繪制成圖，得到圖1。吸光值隨還原糖濃度的升高而升高，且與直線擬合程度較好，基本成一條直線，符合要求。

2.1.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

為了由吸光值得到總糖的質(zhì)量濃度，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到糖濃度與吸光值的函數(shù)關(guān)系，從而對樣品的總糖含量進(jìn)行定量分析。配置一系列梯度濃度的葡萄糖溶液，采用硫酸-蒽酮法，在620nm波長下得到相應(yīng)的吸光值，在由吸光值和濃度繪制成圖，得到下圖2的還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。可知吸光值隨總糖濃度的升高而升高，具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為：y=2.7942x-0.016，R2=0.9924。

2.1.3 氣相乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

配置一系列濃度梯度的乙醇溶液，采用氣相色譜法對樣品的酒精度進(jìn)行測量，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酒精含量與測得峰面積的函數(shù)關(guān)系，從而對樣品的酒精度含量進(jìn)行定量分析。得到酒精含量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。可知，乙醇含量在0～20%時，線性關(guān)系良好，其線性方程為y=199589x-146421，R2=0.998。

2.2 接種試飯的霉菌含量

本次研究共對四種菌種組合的糖化力進(jìn)行了測定，每組設(shè)置三個平行實驗，分別為1+2霉菌組合，1+3霉菌組合，2+3霉菌組合，1+2+3霉菌組合。接種試飯時控制菌種1與霉菌2或3的孢子數(shù)總量比例為1：5。

霉菌接種前，用血球計數(shù)板計數(shù)霉菌孢子懸浮液中的孢子數(shù)量，得到霉菌1為1.1×106個/mL，霉菌2為3.96×106個/mL，霉菌3為1×107個/mL。接種時，為保證菌種總數(shù)一定并保證菌種間的比例，分別向不同霉菌組合中加入不同體積的菌液，見表1。

表1 霉菌組合中接種菌液體積

單位：μL

實驗組 霉菌1

（根霉） 霉菌2

（曲霉） 霉菌3

（毛霉）

1+2 1000 — 720

1+3 1000 — 550

2+3 — 835 330

1+2+3 545 395 300

2.3 試飯?zhí)腔偷矸勖富钚缘臏y定

2.3.1 接種后還原糖濃度的測定

由圖4可知，四組發(fā)酵液中還原糖的含量呈先上升后下降的趨勢，還原糖的產(chǎn)生主要來源于糖化菌的糖化作用。培養(yǎng)的前48h內(nèi)，發(fā)酵液中未加入黃酒酵母，在此階段，霉菌將米飯中的淀粉分解為葡萄糖等可還原性糖，各樣品中還原糖含量均有所升高，菌種長勢良好。并發(fā)現(xiàn)1+2+3霉菌組合的糖化力最強(qiáng)，1+3霉菌組合的糖化力最弱。

此時向各樣品中加入等量酵母，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，還原糖含量繼續(xù)增加。說明霉菌的糖化作用仍然起主導(dǎo)作用，此時酵母處于適應(yīng)期，菌數(shù)少，發(fā)酵能力較弱，霉菌的菌數(shù)較多，糖化能力大于酵母的發(fā)酵能力，造成各樣品中還原糖含量繼續(xù)升高。并發(fā)現(xiàn)1+2+3+4組合的糖化力最強(qiáng)。

培養(yǎng)72h后，由于還原糖積累，有利于酵母的繁殖與代謝，使其數(shù)量增多，發(fā)酵能力增強(qiáng)，導(dǎo)致還原糖含量都有所降低，此時酵母的發(fā)酵能力大于霉菌的糖化能力。

結(jié)果表明，1+2+3組合糖化力最強(qiáng)， 1+2，2+3，1+3組合糖化力依次減弱。所以，黃酒釀造時應(yīng)將1+2+3的菌種組合作為優(yōu)選糖化劑。

2.3.2 接種后總糖濃度的測定

由圖5可知，總糖含量隨培養(yǎng)時間先保持穩(wěn)定不變，加入黃酒酵母后，總糖含量持續(xù)減少。培養(yǎng)的前48 h內(nèi)霉菌將米飯中的淀粉分解為葡萄糖，故樣品中的總糖濃度基本保持不變，因此在未加入酵母前測得的總糖含量即為樣品中總糖含量的初始值。

由每相鄰兩組測得的總糖含量的差值可知，1+2+4霉菌組合與2+3+4霉菌組合中酵母的發(fā)酵能力相當(dāng)且處于中等水平，1+3+4霉菌組合中酵母的發(fā)酵能力最弱，1+2+3+4霉菌組合中酵母的發(fā)酵能力最強(qiáng)。

同時，由各項組合中的兩組平行實驗中的數(shù)據(jù)觀察得到，每組樣品，測量前總糖含量越高，其與測量后的差值相對較大，表明其酵母的發(fā)酵能力較強(qiáng)。經(jīng)分析，是由于樣品中糖濃度較高，有利于酵母的生長繁殖與代謝，促使其發(fā)酵能力保持在較高水平。

2.3.3 接種后樣品中酒精度的測定

由圖6數(shù)據(jù)可知，1+2+3+4組合相同時間內(nèi)產(chǎn)生酒精最多，此種組合中的酵母菌發(fā)酵能力最強(qiáng)，表明1+2+3霉菌組合能夠促進(jìn)酵母菌的發(fā)酵作用，與總糖測定中得到的實驗結(jié)果相符。

同時得到結(jié)論，1+2+4，2+3+4，1+3+4霉菌組合酒精含量依次減少，表明其中酵母的發(fā)酵能力依次漸弱，此結(jié)論與總糖含量測定中的結(jié)論相符。表明這三種霉菌組合對酵母發(fā)酵能力的促進(jìn)作用依次漸弱，甚至對其發(fā)酵作用產(chǎn)生抑制。

3 討論與結(jié)論

通過定量測定不同霉菌組合發(fā)酵黃酒樣品中的還原糖、總糖、酒精度含量，發(fā)現(xiàn)較高的還原糖含量在一定程度上可提高酵母菌的發(fā)酵能力，根霉、曲霉、毛霉組合的共同代謝可促使其糖化能力達(dá)到較高水平，且對酵母的發(fā)酵能力在一定程度上具有促進(jìn)作用。

由此，確定了釀造黃酒的最佳糖化菌組合，即：根霉+曲霉+毛霉組合的糖化力最強(qiáng)，還原糖濃度最高可達(dá)到25.75g/L;根霉+曲霉+毛霉+黃酒酵母的菌種組合對酵母的發(fā)酵最有利，酒精含量最高可達(dá)到3.901%。所以根霉+曲霉+毛霉+黃酒酵母的菌種組合為本次研究中黃酒糖化劑的最佳選擇。

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