Notch信號通路中受體及配體在胃癌組織中的表達及意義

黃博 金國榮 屈重霄 馬海寧 丁彩云

摘 要 目的：檢測了Notch信號通路中各受體及配體在胃癌中的表達，探討Notch信號通路在胃癌發生發展中的作用。方法：應用實時熒光定量PCR法檢測了NOTCH1/2/3/4、JAG1/2、DLL1/3/4在12 例正常胃黏膜組織中的表達情況及在胃癌組織中的異常表達情況；應用免疫印跡法檢測了NOTCH1在對應胃癌/癌旁組織中的表達。結果：在正常組織中受體NOTCH2和配體JAG1的表達水平較高，其余表達水平較低；在胃癌組織中，NOTCH1/3/4和JAG2的表達水平明顯提高，而其他受體和配體的表達水平變化不明顯。NOTCH1蛋白在胃癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高。結論：Notch信號通路中部分受體及配體在胃癌組織中表達明顯提高，Notch信號通路參與了胃癌的發生發展。

關鍵詞 胃癌 Notch信號通路 受體 配體

中圖分類號：R735.2； R730.231 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）15-0057-05

Expressions of the receptors and ligands in Notch signaling pathway in gastric cancer tissues*

HUANG Bo1**， JIN Guorong2， QU Chongxiao3， MA Haining1， DING Caiyun2

（1. Department of General Surgery， 2. Central Laboratory， 3. Department of Pathology， Shanxi Provincial Peoples Hospital， Taiyuan 030012， China）

ABSTRACT Objective： To detect the expressions of receptors and ligands in Notch signaling pathway in gastric cancer tissues and to explore the role of Notch signaling pathway in the occurrence and development of gastric cancer. Methods： The expression levels of NOTCH1/2/3/4， JAG1/2 and DLL1/3/4 in normal gastric tissues and the aberrant expression levels in gastric cancer tissues were studied by real-time RT-PCR. The expression of NOTCH1 protein in gastric cancer or adjacent non-tumor tissues was detected using Western Blotting. Results： The expressions of NOTCH2 and JAG1 were relatively high in normal gastric tissues while the others were relatively low. The expressions of NOTCH1/3/4 and JAG2 were significantly increased in gastric cancer tissues as compared with normal gastric tissues while other receptors and ligands showed little differences. The expression of NOTCH1 protein was significantly higher in gastric cancer tissues than adjacent non-tumor tissues. Conclusion： The expressions of a part of receptors and ligands in Notch signaling pathway are significantly increased in gastric cancer tissues， showing that Notch signaling pathway is involved in the occurrence and development of gastric cancer.

KEY WORDS gastric cancer； Notch signaling； receptor； ligand

胃癌是一種發生于胃黏膜的惡性腫瘤，是消化道常見的癌癥之一，其病死率居常見腫瘤病死率的第3位[1]。世界胃癌患者中有超過70%來自發展中國家，其中中國的胃癌發生率最高[2]。目前外科手術是胃癌治療的主要方法，隨著化療、放療、免疫治療的進步，以及以手術為主的多學科團隊（MDT）的綜合治療的發展，胃癌的治療取得了一定的進步，但并沒有從根本上改變胃癌高死亡率的現狀，其總體生存率和無瘤生存率仍然很低。因此，迫切需要對胃癌進行更深入的研究，尋找治療胃癌更靈敏的分子生物標記物，為胃癌的診斷和治療提供新的突破口。

Notch信號通路在進化上保守，參與許多細胞進程包括增殖、分化、凋亡和干細胞維持等[3]。在哺乳動物中，有四個Notch受體（NOTCH1/2/3/4）和五個配體（Jagged（JAG） 1/2，Delta-like ligand （DLL） 1/3/4），這些受體和配體的精確調控，對大多數組織的正常發育至關重要，其異常調控可引起組織發育異常，甚至導致腫瘤的發生[4]。大量研究表明Notch信號通路在癌癥的發生發展過程中有重要作用，但是其在胃癌發生發展進程中的作用尚存在爭議。有研究表明NOTCH1在胃癌中表達較正常組織明顯上調，并與腫瘤的大小、分化程度、浸潤程度顯著相關[5]。NOTCH1配體JAG1表達上調的胃癌患者預后差、生存率低[6]。單因素生存分析結果發現，NOTCH1陽性組預后較陰性組差，多因素生存分析結果顯示，NOTCH1表達是影響胃癌預后的獨立因素[7]。但仍有另外研究表明NOTCH1在胃癌中可能發揮抑癌作用，NOTCH1在胃癌組織中表達下調，NOTCH1的表達對胃癌的預后有積極作用[8]。因此，目前對Notch信號通路在胃癌中的作用沒有得到完全闡明。本研究選擇Notch信號通路為研究對象，檢測了Notch信號通路各受體及配體在胃癌中的表達及作用，以期獲得更多Notch信號通路參與胃癌的證據，為胃癌的早期診斷和靶向治療提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集山西省人民醫院2016年6月至2016年10月間胃癌根治術所獲得的胃癌及癌旁組織標本12組。所有胃癌患者均經病理檢查證實為胃部惡性腫瘤，并排除并發其他疾病，且術前均未接受任何形式的放化療及靶向治療，患者均為散發病例，無家族史。其中男9例，女3例，平均年齡（57.6±11.6）歲。組織學分化等級為低分化5例，中低分化4例，中分化3例。同時選擇切緣部癌旁組織為對照，均經病理證實為正常胃黏膜組織。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒（柱式總RNA抽提試劑盒，上海生工工程有限公司）；反轉錄試劑盒（PrimeScript？ RT Master Mix （Perfect Real Time），寶生物工程（大連）有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（SYBR？ Premix Ex Taq？ II （Tli RNaseH Plus），寶生物工程（大連）有限公司）；組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE電泳試劑盒、ECL顯影試劑盒（博士德生物）。PCR使用的引物由華大基因合成，引物序列見表1。NOTCH1抗體（ab52627，美國Abcam公司）。實時熒光定量PCR儀（CFX96，美國Bio-Rad公司）。

1.3 實時熒光定量PCR

1.4 蛋白質印跡法

將組織標本于液氮中速凍后進行研磨，使用RIPA裂解液進行裂解，離心后取上清即為組織蛋白。使用BCA法在多功能讀數儀上測定蛋白濃度。制備5%濃縮膠、10%分離膠的SDS-PAGE凝膠，取50 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。然后，使用電轉儀將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜。使用NOTCH1抗體、GAPDH抗體一抗孵育過夜，TBS洗滌5 min×3次。使用偶聯辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，TBS洗滌5 min×6次。最后，使用增強化學發光法（ECL）顯色，在成像系統（ChemiDoc XRS+，美國BioRad公司）中攝影。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 Notch信號通路受體及配體在正常組織及胃癌組織中的表達量比較

實時熒光定量PCR的結果顯示：在正常組織中，與β-actin相比，Notch信號通路各受體及配體的表達參差不齊，其中4個受體中NOTCH2的表達水平較高，其余表達水平較低；5個配體中，JAG1的表達水平較高，JAG2的表達水平較低，其余居中（圖1）。

在胃癌組織中，與正常組織相比，Notch信號通路各受體及配體的表達發生了不同程度的變化。其中3個受體（NOTCH1/3/4）的表達水平明顯提高，而NOTCH2的表達水平變化不明顯。配體中JAG2的表達水平明顯提高，而其他配體的表達水平的變化不明顯（圖2）。在正常胃組織中表達比較高的基因，在胃癌發生后，其變化不很明顯；但是在正常胃組織中表達較低的基因，在胃癌發生后其表達卻顯著提高。

2.2 NOTCH1在胃癌/癌旁組織中的表達

使用蛋白質印記法進一步驗證NOTCH1蛋白在胃癌、癌旁組織中的表達。結果顯示：在6對胃癌/癌旁組織中，NOTCH1在其中4例胃癌組織中的表達均明顯高于相應的癌旁組織（P2、P4、P5、P6），在2例胃癌組織中的表達與相應的癌旁組織沒有明顯差異（P1、P3）（圖3）。

使用熒光定量PCR法證實NOTCH1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

3 討論

1991年，NOTCH1在人急性T淋巴細胞白血病中被鑒定出來，首次提示Notch信號通路與腫瘤相關[10]。越來越多的證據表明Notch信號通路不僅是血液系統惡性腫瘤的原因，其在實體瘤如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌等中也起著關鍵作用[4]。研究發現，Notch信號通路在胃癌的發生發展中也發揮著重要作用[11]。來自不同的研究表明，Notch信號通路各受體及配體在胃癌的進程中發揮不同的作用。例如，對876個胃癌病人長達20年的隨訪研究發現，NOTCH1/2/3/4的高表達與總生存期存在負相關[12]。NOTCH1在胃癌中的表達越高，其分化程度越低[13]。此外，NOTCH1的高表達還與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、Lauren分型有關[5]。JAG1被認為是胃癌獨立的預后預測因子，它的陽性表達提示與預后不良有關[14]。JAG2和NOTCH3的表達在腸型胃癌中明顯升高，其表達升高不僅與胃癌的發展有關，還與腸/腺型分化有關[15]。DLL1在胃癌中出現異常甲基化和高表達[16]。DLL4的過表達促進了胃癌干細胞的自我更新能力同時還與臨床結局有關[17]。

本研究發現，在正常胃黏膜組織中，Notch信號通路中的各受體和配體的表達參差不齊，其中NOTCH2和JAG1表現出較高的表達水平。但有趣的是，在正常胃組織中表達比較高的NOTCH2和JAG1，在胃癌組織中的表達水平相當，沒有發生明顯變化；反而是在正常胃組織中表達較低的NOTCH1/3/4和JAG2，在胃癌發生后其表達顯著提高，說明NOTCH1/3/4和JAG2在胃癌進程中發揮重要作用。但是Notch信號通路中各受體及配體之間如何相互調節，不同的受體及配體又如何調控胃癌的發生發展還需要進一步的研究。目前關于NOTCH1在胃癌中的作用研究較多，但仍然存在兩種不同的結論。大部分研究結果支持NOTCH1在胃癌發展中發揮癌基因的作用，但是仍有部分研究表明NOTCH1在胃癌中表達降低，認為NOTCH1在胃癌中發揮抑癌基因的作用[8]。本研究進一步驗證了NOTCH1在胃癌及癌旁組織中的表達，結果證實NOTCH1在胃癌組織中表達明顯提高，提示NOTCH1在胃癌的發生發展過程中起到促進作用。

綜上，本研究發現Notch信號通路中的配體和受體在正常胃組織中的表達具有差異性，在胃癌組織中受體NOTCH1/3/4和配體JAG2的表達明顯提高，提示其參與了胃癌的發生發展。對NOTCH1蛋白的表達研究進一步證實了NOTCH1在胃癌中發揮癌基因的作用。但是Notch信號通路中受體和配體的相互作用以及Notch信號通路下游分子如何參與胃癌的發生發展需要進一步的研究，以期為胃癌的早期診斷和靶向治療提供分子依據。

參考文獻

[1] Torre LA， Bray F， Siegel RL， et al. Global cancer statistics， 2012[J]. CA Cancer J Clin， 2015， 65（2）： 87-108.

[2] Lin Y， Ueda J， Kikuchi S， et al. Comparative epidemiology of gastric cancer between Japan and China[J]. World J Gastroenterol， 2011， 17（39）： 4421-4428.

[3] Koch U， Radtke F. Notch and cancer： a double-edged sword[J]. Cell Mol Life Sci， 2007， 64（21）： 2746-2762.

[4] Ranganathan P， Weaver KL， Capobianco AJ. Notch signaling in solid tumors： a little bit of everything but not all the time[J]. Nat Rev Cancer， 2011， 11（5）： 338-351.

[5] Luo DH， Zhou Q， Hu SK， et al. Differential expression of Notch1 intracellular domain and p21 proteins， and their clinical significance in gastric cancer[J]. Oncol Lett， 2014， 7（2）： 471-478.

[6] Xiao HJ， Ji Q， Yang L， et al. In vivo and in vitro effects of microRNA-124 on human gastric cancer by targeting JAG1 through the Notch signaling pathway[J]. J Cell Biochem， 2018， 119（3）： 2520-2534.

[7] Zhang H， Wang X， Xu J， et al. Notch1 activation is a poor prognostic factor in patients with gastric cancer[J]. Br J Cancer， 2014， 110（9）： 2283-2290.

[8] Zhou W， Fu XQ， Zhang LL， et al. The AKT1/NF-kappa B/ Notch1/PTEN axis has an important role in chemoresistance of gastric cancer cells[J/OL]. Cell Death Dis， 2013， 4： e847. doi： 10.1038/cddis.2013.375.

[9] Kenneth JL， Thomas DS. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[10] Ellisen LW， Bird J， West DC， et al. TAN-1， the human homolog of the Drosophila notch gene， is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell， 1991， 66（4）： 649-661.

[11] Yao Y， Ni Y， Zhang J， et al. The role of Notch signaling in gastric carcinoma： molecular pathogenesis and novel therapeutic targets[J]. Oncotarget， 2017， 8（32）： 53839-53853.

[12] Wu X， Liu W， Tang D， et al. Prognostic values of four Notch receptor mRNA expression in gastric cancer[J/OL]. Sci Rep， 2016， 6： 28044. doi： 10.1038/srep28044.

[13] Hu S， Chen Q， Lin T， et al. The function of Notch1 intracellular domain in the differentiation of gastric cancer[J]. Oncol Lett， 2018， 15（5）： 6171-6178.

[14] Du X， Cheng Z， Wang YH， et al. Role of Notch signaling pathway in gastric cancer： a meta-analysis of the literature[J]. World J Gastroenterol， 2014， 20（27）： 9191-9199.

[15] Kang H， An HJ， Song JY， et al. Notch 3 and Jagged 2 contribute to gastric cancer development and to glandular differentiation associated with MUC 2 and MUC5AC expression[J]. Histopathology， 2012， 61（4）： 576-586.

[16] Shen CH， Tung SY， Tseng MJ， et al. Inverse correlation between methylation and expression of the delta-like ligand 1 gene in gastric cancer[J]. Chin J Physiol， 2018， 61（2）： 65-74.

[17] Miao ZF， Xu H， Xu HM， et al. DLL4 overexpression increases gastric cancer stem/progenitor cell self-renewal ability and correlates with poor clinical outcome via Notch-1 signaling pathway activation[J]. Cancer Med， 2017， 6（1）： 245-257.