Gene Xpert MTB/RIF檢測早期診斷結核性腦膜炎

金慧芳 劉 鑫

內蒙古自治區第四醫院 1)內六科 2)胸外科，內蒙古 呼和浩特 010080

結核病是目前人類已知的單一致死性最高的傳染性疾病。我國是2015年世界上新發結核病數量第三大的國家，也是全球13個同時位列結核病、結核病和HIV雙重感染以及MDR-TB領域中的高負擔國家之一[1-3]。中樞神經系統結核是由結核分枝桿菌引起的肺外結核中最嚴重的類型，占所有結核病例的5%～10%[4]。在中樞神經系統結核中，結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的類型。TBM不僅發病率高，而且病死率可達15%～30%，是最為常見且最為嚴重的肺外結核病之一[5]。TBM的早期診斷治療與其預后密切相關。除腦脊液常規、生化檢查外，TBM的實驗室診斷還包括腦脊液結核桿菌快速培養、結核抗體的檢測以及實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)等[6]。隨著醫療檢測設備的不斷發展和完善，Gene Xpert MTB/RIF開始出現在TBM的檢測中。作為臨床新興的檢測方法，其可為TBM的早期診斷提供可靠的依據[7]。本研究主要評估Gene Xpert MTB/RIF檢測技術在TBM早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1．1一般資料選擇2015-10—2017-03在內蒙古第四醫院住院治療的腦膜炎患者。結腦組86例，男34例，女52例；年齡11～67(35.42±11.65)歲；均符合TBM診斷標準[8]：有密切的結核病接觸史或腦外結核病史，發病緩慢，有結核毒性癥狀，有顱內高壓、腦膜刺激征及其他神經系統癥狀、體征，腦脊液實驗室檢查符合非化膿性腦膜炎表現，排除其他細菌、病毒及HIV等引起的中樞神經系統感染和其他復合病因，且抗結核治療有效。非結腦組32例，男20例，女12例；年齡18～72(41.54±16.35)歲；參照人民衛生出版社第6版《神經病學》[9]中的標準進行確診，包括病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎等。所有病例通過臨床治療轉歸并綜合各項檢查結果后最終確診。

1．2方法

1．2．1 標本留取：所有患者入院后在嚴格無菌操作下行腰椎穿刺術，并留取腦脊液約6 mL送檢驗科分別行抗酸染色涂片、結核分枝桿菌培養、實時熒光定量PCR(FQ-PCR)以及Gene Xpert MTB/RIF檢測。

1．2．2 抗酸染色涂片檢測、結核菌培養及FQ-PCR檢測：按照《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[10]的要求進行相應檢測和結果判定。

1．2．3 Gene Xpert MTB/RIF檢測：按照Gene Xpert MTB/RIF檢測系統儀器使用說明書進行操作(美國Cepheid公司)，檢測結果自動判讀。MTB檢測等級分為陰性(未檢出)、極低、低、中等、高；耐藥檢測分為利福平耐藥、利福平敏感、不確定(即利福平耐藥結果無法判讀)。

2 結果

2．1不同方法對結核性腦膜炎患者腦脊液標本的檢測結果結腦組86例，腦脊液Gene Xpert MTB/RIF結果顯示60例陽性，26例陰性；FQ-PCR結果顯示56例陽性，30例陰性；抗酸染色涂片6例陽性，80例陰性；結核分枝桿菌培養17例陽性，69例陰性。非結腦組32例，除1例腦脊液FQ-PCR陽性外，其余腦脊液Gene Xpert MTB/RIF、抗酸染色涂片及結核分枝桿菌培養均為陰性。見表1。

2．2 4種不同檢測方法結果比較以臨床診斷或排除結腦并經治療后隨診證實為TBM或非結腦為標準，腦脊液Gene Xpert MTB/RIF檢測的敏感度、特異性、符合率、陽行預測值及陰性預測值分別為69.8%(60/86)、100%(32/32)、77.9%(92/118)、100%(60/60)、55.2%(32/58)，符合率高于其他3種檢測技術，與抗酸染色涂片及結核分枝桿菌培養比較差異有統計學意義(P<0.05)；診斷一致性評價中，腦脊液Gene Xpert MTB/RIF檢測的Kappa=0.792，P<0.01。見表3。

表1 結腦組與非結腦組不同方法的檢測結果Table 1 Results of different methods in the two groups

表2 不同檢測方法對結核性腦膜炎的診斷試驗評價 (%)Table 2 Diagnostic test evaluation of different detection methods for tuberculous meningitis

表3 診斷試驗的一致性檢驗Table 3 Consistency test of diagnostic test

3 討論

TBM是由結核桿菌侵犯蛛網膜下腔引起的一種最常見的中樞神經系統結核病。不論是兒童還是成人，TBM都是肺外結核最嚴重的表現形式，是致殘、致死的最主要原因之一。近年來，隨著多耐藥結核分枝桿菌的流行、免疫抑制劑的廣泛應用以及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的增加，全球結核病發病率明顯上升，TBM也逐年增多[11，25-26]。TBM不僅起病緩慢、早期臨床表現無明顯特異性、腦脊液載菌量低且病原微生物檢出率不高、時間長以及病理學診斷不易獲得，使得TBM的確診十分困難[12，27-28]，常被誤診為病毒性或化膿性腦膜炎。臨床常通過對患者的結核接觸史、臨床表現、頭部影像學檢查以及腦脊液檢查等綜合判斷以及診斷性的抗結核治療進行確診，易引起誤診誤治或延誤治療而造成較嚴重的并發癥、后遺癥及死亡。研究顯示，早期確診的TBM病死率<10%，而晚期確診的TBM病死率卻高達60%[13，29-30]。因此，快速、準確、特異性高的TBM早期診斷方法是改善患者預后的關鍵，也是臨床醫師迫切想要解決的問題。

2010年南非結核性腦膜炎專家共識認為，腦脊液培養、抗酸涂片或多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)仍是診斷TBM的“金標準”。傳統的結核菌培養不僅陽性率低且耗時較長，而BACTEC MGIT960等快速培養系統雖然具備培養時間短、陽性率高等優點，但仍有污染、假陽性以及設備昂貴等缺點。抗酸染色法雖操作簡便、快速且價格低廉，但敏感性較低，易出現假陰性等情況，而改良的抗酸染色法雖提高了檢測的敏感性，但因抗酸桿菌均能著色，因此菌種的區分仍不能實現。PCR等核酸擴增技術具有快速、敏感、高效等優點，對早期診斷TBM有獨特的優越性，但操作過程復雜、易出現交叉污染，致使出現假陽性的情況。此外，PCR檢測往往要求設備精良，在大多數基層醫院無法普及。

隨著檢測設備及手段的不斷進步，Gene Xpert MTB/RIF檢測系統的問世，為結核病的早期診斷提供了快速、有效的確診方法[14-15，31]。該技術是一種基于巢式PCR技術發展而來的基因擴增技術，能夠在2 h內針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區間(RRDR)設計引物、探針，檢測其是否發生突變，進而用于診斷結核及檢測利福平耐藥(rpoB序列存在突變)[16，32]。Gene Xpert MTB/RIF技術作為WHO唯一最新推薦的用于結核分枝桿菌及利福平耐藥快速檢測的手段，具有污染可能性小、檢測樣本多樣、操作簡單、檢測周期短、敏感性高、特異度強、對實驗室要求較低等特點，使其成為結合診斷方面具有里程碑意義的新方法[17，33]。Gene Xpert MTB/RIF作為肺結核及耐藥肺結核診斷領域里的新技術已經得到較為廣泛的應用。但關于該項技術對于肺外結核的研究相對較少，其診斷價值尚缺乏統一的認識。國內外相關研究的Meta分析顯示[18-19，34]，Gene Xpert MTB/RIF檢測技術在肺外結核診斷中的敏感度25.0%～96.6%，而特異度則基本保持在100%左右，說明該技術在肺外結核的診斷中同樣具有較高的價值；而在胸腹腔積液、腦脊液、心包積液等不同部位的Gene Xpert MTB/RIF肺外結核檢測中所得到的敏感度和特異性有較高的異質性，這就需要對這類情況進行更為深入的研究[20-21，35]。

本研究中，以臨床診斷或排除結腦并經治療后隨診證實為TBM或非結腦為標準，評價腦脊液Gene Xpert MTB/RIF檢測的敏感度和特異性，結果顯示，Gene Xpert MTB/RIF檢測腦脊液中結核分枝桿菌的敏感度為69.8%，符合率為77.9%，除與FQ-PCR的65.1%敏感度以及73.7%的符合率差異無統計學意義外，與抗酸染色涂片及結核分枝桿菌培養的敏感度、符合率差異均有統計學意義，與相關文獻報道基本一致[22-23，36]。因此，Gene Xpert Mtb/RIF技術相對于傳統抗酸染色、結核分枝桿菌培養而言，不但提高了敏感度，而且最大程度縮短了檢測時間，尤其對結核分枝桿菌的耐藥性檢測更具優勢[24]。另外，FQ-PCR的檢測步驟多，容易受操作相關因素的影響而導致檢測結果存在一定的假陽性和假陰性，而Gene Xpert MTB/RIF操作簡單、全程自動化，有效避免了上述因素的影響，因而可以更好地滿足臨床需求。在診斷試驗的一致性檢驗中，Gene Xpert Mtb/RIF技術(K=0.792)高于其他抗酸染色(K=0.062)、結核分枝桿菌培養(K=0.172)以及FQ-PCR(K=0.463)，表明其具有較高的臨床診斷價值。此外，本研究中檢測陽性的60份腦脊液中20份含量顯示為極低濃度，32份顯示為低濃度，8份顯示為中等濃度，未檢測出高濃度的腦脊液。一方面，可能由于血腦屏障造成的相對無菌的環境，使得腦脊液中結核菌含量相對較少；另一方面，可能與本次研究未納入合并HIV感染者有關，而入組患者的機體免疫力強，巨噬細胞對結核桿菌的吞噬消滅作用強，造成結核桿菌數量較少。因此，今后是否可以采用集菌、破膜等方法增加腦脊液中菌濃度及DNA濃度提高Gene Xpert MTB/RIF的陽性檢出率，還需進一步研究驗證。

Gene Xpert MTB/RIF檢測法相對于抗酸染色涂片、結核分枝桿菌培養以及FQ-PCR在診斷TBM方面有更為顯著的優勢，能夠有效幫助臨床醫生對疑似TBM的患者進行早期診斷，降低致殘率、致死率，提高患者的生存質量。