qPCR快速檢測金黃色葡萄球菌及MRSA方法的建立及評價

竇宇紅,梁 鴻,何 玥,劉和錄,劉 瓊,馬彩鳳,李玉霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院,廣東 深圳 518104)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是人類的一種重要病原菌，既可引起嚴(yán)重的社區(qū)獲得性感染[1]，也可引起嚴(yán)重的醫(yī)源性感染[2]。由于其癥狀與其他細(xì)菌感染無明顯差異，臨床難以針對該菌感染進(jìn)行早期精準(zhǔn)診斷，且其耐藥問題日益突出，嚴(yán)重影響治療效果[3]。培養(yǎng)法是目前常用的檢測方法，也是金標(biāo)準(zhǔn)，但需2～3 d，甚至更久，其時效性、簡便性、靈敏度等均無法滿足臨床快速精準(zhǔn)診斷的需求[4]。研究通過多重降落聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法檢測血流耐甲氧西林SA(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染，結(jié)果具有高靈敏度與特異度，有利于指導(dǎo)臨床使用抗菌藥物[5]。但通過電泳分析PCR產(chǎn)物，易造成實驗室污染而出現(xiàn)假陽性。沈蕾等[6]比較上海之江的MRSA-PCR快速檢測方法，發(fā)現(xiàn)除陰性預(yù)測值較好外，靈敏度、特異度及陽性預(yù)測值均較低[6]。筆者基于Taqman探針技術(shù)，同時檢測SA種屬特異性和耐藥基因效果較好，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究樣本 (1)隨機(jī)復(fù)蘇筆者醫(yī)院2015年1月—2017年12月凍存的經(jīng)生化反應(yīng)或質(zhì)譜鑒定為SA的菌株93株(含32株MRSA)、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)93株[含26株耐甲氧西林CNS(MRCNS)]及金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 43300用于引物、探針篩選。(2)留取同期筆者醫(yī)院就診的SA感染患者樣本335份(含MRSA感染94份)及培養(yǎng)陰性的膿性樣本95份用于診斷評價。

1.2 儀器與試劑 (1)細(xì)菌分離培養(yǎng)基購自鄭州安圖公司，包括哥倫比亞血瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂；血培養(yǎng)儀(BacT/ALERT 3D 120)、細(xì)菌鑒定藥敏分析儀(VITEK 2 Compact)、質(zhì)譜鑒定儀(VITEK MS)、染色儀(PREVITWColor Gram)及其配套試劑均購自法國生物梅里埃公司。(2)核酸提取儀(ExPure20)及其配套磁珠法提取純化試劑購自深圳市匯研科創(chuàng)公司。(3)熒光定量PCR儀(LightCycler480) 購自德國羅氏公司，多重?zé)晒舛縋CR 體系(PlatinumTMMultiplex PCR Master Mix)購自美國賽默飛公司。(4)PCR產(chǎn)物測序委托Life technologies公司完成。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與MRSA檢測 增菌、分離及純化培養(yǎng)、革蘭染色、生化鑒定、質(zhì)譜鑒定、MRSA檢測等均嚴(yán)格按儀器及其配套試劑SOP文件操作，按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S27標(biāo)準(zhǔn)，將頭孢西丁最低抑菌濃度(MIC)≥8 μg/mL判斷為MRSA[7]。

1.4 核酸提取與純化 (1)純培養(yǎng)物核酸提取：挑取復(fù)蘇后的對數(shù)生長期純培養(yǎng)菌落，用生理鹽水調(diào)成0.5～1.0 麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙海? h內(nèi)完成菌懸液核酸提取。(2)原始樣本核酸提取：各類原始樣本接種完畢后，選用對應(yīng)的核酸提取試劑盒，嚴(yán)格按儀器及配套試劑SOP進(jìn)行操作。(3)提取純化后的核酸模板吸入無DNA酶EP管，凍存于-86℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物/探針設(shè)計、合成、標(biāo)記 從NCBI數(shù)據(jù)庫，分別下載SA耐熱核酸酶(thermonuclease,nuc)、自溶素(autolysin，atl)、細(xì)胞黏附素B(intercellular adhesin,icaB)、纖維粘連蛋白結(jié)合蛋白A(fibronectin-binding protein,fnbA)、α溶血素(alpha hemolysin,hla)、富絲氨酸血小板黏附素(serine-rich adhesin for platelets，srap)、青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin-binding protein 2a,mecA)基因序列各100條，用DNA MAN進(jìn)行序列比對，用Primer 5軟件，避開變異區(qū)或突變點(diǎn)后，分別設(shè)計各基因的引物和探針，每個基因設(shè)計1～2套，委托Life technologies公司合成及標(biāo)記。SAnuc、atl、icaB、fnbA、hla、srap、mecA基因引物、探針設(shè)計及標(biāo)記結(jié)果見表1。

表1 SA各基因引物/探針設(shè)計與標(biāo)記Table 1 Primer/probe sequence and fluorogenic labeling of each SA gene

1.6 qPCR擴(kuò)增及結(jié)果判斷 (1)qPCR體系：Multiplex PCR Mix 25.0 μL，10 μmol正反引物各1.0 μL，10 μmol探針各0.3 μL,模板20.0 μL，補(bǔ)水至終體積50.0 μL。(2)擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)，選擇510、580、610、670 nm通道于60℃探測熒光。(3)鑒定結(jié)果判斷：鑒定標(biāo)志物擴(kuò)增曲線呈“S”形，CT值≤36，且臨界陽性CT值≥36，陰性對照CT值≤40，判為陽性，否則判為陰性。(4)MRSA結(jié)果判斷：MRSA及鑒定標(biāo)志物擴(kuò)增曲線均呈“S”形，CT值均≤36，且臨界陽性CT值均≥36，陰性對照CT值均≤40，判為陽性，否則判為陰性。

1.7 檢測下限及擴(kuò)增線性范圍試驗 (1)挑取對數(shù)生長期的兩個標(biāo)準(zhǔn)株(金黃色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 43300)純培養(yǎng)菌落，分別用生理鹽水調(diào)制成濃度約為3.0×108CFU/mL的菌懸液，經(jīng)3次平板傾注法菌落計數(shù)均值確定菌懸液濃度，再用生理鹽水稀釋菌懸液至2.0×108CFU/mL后提取核酸，以1個細(xì)菌對應(yīng)1 Copy模板確定模板濃度，其中，金黃色葡萄球菌ATCC 43300用于mecA試驗,金黃色葡萄球菌ATCC 25923用于其他基因試驗。(2)用超純水，10倍梯度稀釋核酸模板，制成8個梯度濃度模板，用于PCR擴(kuò)增，以能判陽的最低加入模板數(shù)作為檢測下限；以線性關(guān)系良好的最低和最大濃度作為擴(kuò)增線性范圍。

1.8 基因片段靈敏度、特異度計算 (1)鑒定標(biāo)志物靈敏度=鑒定基因片段qPCR陽性數(shù)÷SA株數(shù)×100%；MRSA標(biāo)志物靈敏度=MRSA基因片段qPCR陽性數(shù)÷MRSA株數(shù)×100%。(2)鑒定標(biāo)志物特異度=鑒定基因片段qPCR陰性數(shù)÷CNS株數(shù)×100%；MRSA標(biāo)志物特異度=MRSA基因片段qPCR陰性數(shù)÷非MRSA株數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 SA培養(yǎng)鑒定與MRSA檢測結(jié)果 2015年1月—2017年12月共分離SA 335株，其標(biāo)本分布與MRSA檢出率見表2。

表2 335株SA標(biāo)本分布及MRSA檢出率Table 2 Specimen distribution and MRSA isolation rates of 335 strains of SA

2.2 SA藥物敏感試驗結(jié)果 94株MRSA、241株甲氧西林敏感SA(MSSA)及全部菌株藥敏試驗結(jié)果見圖1。355株金葡菌中MRSA與MSSA對青霉素、紅霉素及克林霉素耐藥性差別較大，并且敏感率較低。

圖1 SA藥物敏感試驗結(jié)果Figure 1 Antimicrobial susceptibility testing results of SA

2.3 SA各基因引物、探針篩選結(jié)果 SAnuc、atl、icaB、fnbA、hla、srap、mecA基因引物、探針篩選結(jié)果見表3。根據(jù)擴(kuò)增效率、檢測下限、靈敏度及特異度選擇atl片段1及mecA片段1作為檢測標(biāo)志物。

表3 SA各基因引物/探針篩選結(jié)果Table 3 Screening results of primer/probe for each SA gene

2.4 qPCR檢測原始樣本結(jié)果 用檢測性能最好的atl基因片段1及mecA基因片段1建立雙重qPCR，經(jīng)引物濃度、探針濃度、退火溫度、延伸時間等優(yōu)化后，檢測430份原始標(biāo)本，結(jié)果培養(yǎng)法陽性的335份SA及94份MRSA標(biāo)本，qPCR檢測全部陽性；95份SA培養(yǎng)法陰性的標(biāo)本，qPCR檢測SA陽性 17份，MRSA陽性4份，且經(jīng)PCR產(chǎn)物一代測序，與標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性均≥90%。見表4。

表4 430份原始標(biāo)本常規(guī)培養(yǎng)法與qPCR檢測結(jié)果(份)Table 4 Results of routine culture and qPCR in 430 original specimens(No. of specimens)

3 討論

SA是醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌[8]。本研究的鑒定和藥敏結(jié)果顯示，SA可引起多部位、多系統(tǒng)感染，甚至顱內(nèi)感染，其對青霉素、紅霉素等抗菌藥物的耐藥形勢不容樂觀，且MRSA的耐藥問題依然嚴(yán)峻，建立快速的檢測方法具有現(xiàn)實意義。

既往有多位學(xué)者選用不同的基因片段作為標(biāo)志物，建立PCR方法用于檢測SA和(或)MRSA，但效果參差不齊。2006年溫冬青等[9]學(xué)者建立的MGB探針法檢測MRSA，經(jīng)20份標(biāo)本和20株菌株評價,檢測和診斷性能良好。2007年朱以軍等[10]學(xué)者建立的qPCR方法檢測MRSA，經(jīng)109株SA評價，檢出率為33.9%(37/109)，高于苯唑西林紙片擴(kuò)散法的24.8%(27/109)，但檢測下限為104Copies/mL。2011年牟曉峰等[11]學(xué)者建立的qPCR方法檢測MRSA，經(jīng)182株SA評價, 其檢測和診斷性能也很理想。但上述學(xué)者建立的方法不能檢測SA種屬特異基因，也未進(jìn)行MRCNS驗證。由于MRCNS中的mecA基因序列與MRSA中的并無差異，當(dāng)檢測原始標(biāo)本時，很可能將MRCNS報告成MRSA誤導(dǎo)臨床。2013年龔玉姣等[12]建立了雙重PCR方法檢測MRSA，能同時擴(kuò)增種屬特異基因Coag和mecA，驗證85株SA，結(jié)果與培養(yǎng)法一致，但不能進(jìn)行實時熒光定量檢測，PCR產(chǎn)物容易造成實驗室污染。

本研究對6個常用于鑒定的種屬特異基因共10個片段，以及mecA基因2個片段進(jìn)行篩選，選取檢測性能最佳的片段作為標(biāo)志物建立雙重qPCR方法，經(jīng)430份原始標(biāo)本驗證，不僅能將培養(yǎng)法陽性的335份SA及94份MRSA標(biāo)本全部檢測出陽性，還從95份SA培養(yǎng)法陰性的標(biāo)本中，檢出了17份標(biāo)本SA及4份標(biāo)本MRSA陽性，且經(jīng)PCR產(chǎn)物一代測序，與標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性均≥90%。qPCR法檢測SA陽性數(shù)多于培養(yǎng)法，其原因可能是培養(yǎng)法容易受抗菌藥物使用、標(biāo)本運(yùn)送、接種時機(jī)等因素影響，造成結(jié)果陰性。qPCR法檢測MRSA陽性數(shù)也多于培養(yǎng)法，其原因可能是部分SA已經(jīng)攜帶mecA基因，但體外實驗時，該基因表達(dá)下調(diào)或被抑制，故有學(xué)者認(rèn)為檢測mecA基因應(yīng)作為 MRSA判別的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13-14]。本研究方法既可鑒定SA，也可檢測MRSA，與培養(yǎng)法比，不僅可提高陽性率，且檢測時間≤2.0 h，能有效彌補(bǔ)培養(yǎng)法耗時太長的缺點(diǎn)。

本研究組在篩選基因片段作為qPCR標(biāo)志物的過程中發(fā)現(xiàn)，不同的基因，甚至是同一基因不同片段，作為檢測標(biāo)志物時均存在差異，與國外學(xué)者[15-16]結(jié)果類似。說明不是每個基因及其片段均適合作為qPCR檢測標(biāo)志物，特別是僅根據(jù)NCBI或文獻(xiàn)等既往資料設(shè)計的引物和探針，由于生物進(jìn)化、地區(qū)分布不同等原因，基因序列存在SNP多態(tài)性，可能導(dǎo)致檢測靈敏度和特異性不高。目前，不同qPCR檢測試劑盒檢測結(jié)果不一致，也可能是由以上原因?qū)е碌摹Ｋ裕⒎肿釉\斷方法前，對標(biāo)志物進(jìn)行篩選，有利于提高診斷靈敏度和特異度。

本研究組建立的qPCR方法尚未在其他地區(qū)或機(jī)構(gòu)進(jìn)行驗證，其檢測性能是否能保持一致，有待進(jìn)一步驗證。