耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制與分子流行病學(xué)特征

張志軍，鹿 麟，牛法霞，趙 珂，姜梅杰，趙書平

(1 泰安市中心醫(yī)院, 山東 泰安 271000; 2 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院, 上海 200120; 3 勝利油田中心醫(yī)院, 山東 東營(yíng) 257000; 4 泰山醫(yī)學(xué)院, 山東 泰安 271016)

碳青霉烯類抗生素作為治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的首選藥物受到廣泛關(guān)注，近年來隨著臨床上對(duì)該類藥物應(yīng)用的增加，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)已呈全球性播散，對(duì)臨床感染的治療造成極大的威脅[1]。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的主要機(jī)制，碳青霉烯酶可廣泛水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，并可隨著質(zhì)粒播散而導(dǎo)致大范圍的流行[2]。美國疾病控制與預(yù)防中心將CRKP列入了目前“最棘手的細(xì)菌”[3]。為此，本研究對(duì)2014年泰安市中心醫(yī)院臨床感染標(biāo)本中分離獲得的13株CRKP的耐藥基因攜帶情況及分子流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了分析，旨在為臨床治療此種細(xì)菌引起的感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，同時(shí)有助于及時(shí)有效的控制其流行。

1 資料與方法

1.1 資料來源 2014年1—11月醫(yī)院臨床各類標(biāo)本中分離的所有CRKP菌株(剔出同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株)，共計(jì)13株。

1.2 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌的分離、培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行，使用WalkAway 96 PLUS型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，替加環(huán)素的敏感性使用Etest法。

1.3 改良Hodge試驗(yàn)及EDTA 協(xié)同試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 耐藥基因檢測(cè) 采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)方法檢測(cè)碳青霉烯酶基因blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaNDM-1等，引物序列參照文獻(xiàn)[4-5]，對(duì)陽性基因進(jìn)行測(cè)序，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析。

1.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)和多位點(diǎn)序列分型 (multilocus sequence typing，MLST) PFGE參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行，參考菌株為沙門菌H9812，應(yīng)用Gel Doc系統(tǒng)對(duì)圖像(Bio-Rad，美國)進(jìn)行拍照。MLST中肺炎克雷伯菌7個(gè)管家基因的引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見MLST網(wǎng)站，測(cè)序結(jié)果通過MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得該菌株相應(yīng)的序列型別(sequence type，ST)，使用eBURST軟件分析STs之間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 菌株檢出情況 13株CRKP的標(biāo)本來源主要是痰及尿，分別為7株(53.85%)和4株(30.77%)，1株(7.69%)分離自血標(biāo)本，1株(7.69%)分離自分泌物。CRKP主要來源于各重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)，其中神經(jīng)外科ICU、老年一科病房、急診科ICU、綜合ICU各檢出2株，血液內(nèi)科病房、口腔科門診、兒內(nèi)二科病房、新生兒ICU、泌尿外科病房各檢出1株。分離出CRKP菌株的患者多數(shù)有基礎(chǔ)性疾病、外傷或免疫力低下，病情較為嚴(yán)重，如腦出血、多器官損傷等，13株CRKP來源情況見表1。

表1 13株CRKP標(biāo)本來源、科室分布及患者情況Table 1 Specimen sources, department distribution, and patients’ condition of 13 CRKP strains

表2 CRKP對(duì)主要抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[株數(shù)(%)]Table 2 Antimicrobial susceptibility testing results of CRKP(No. of isolates [%])

2.3 改良Hodge試驗(yàn)及EDTA 協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果 13株CRKP改良Hodge試驗(yàn)均為陽性；5株菌EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性，分別為Kp4、Kp8、Kp9、Kp10與Kp12，其余為陰性。見圖1和圖2。

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 取KPC陽性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為 KPC-2 基因，與編碼 CP028790.1序列100%同源，碳青霉烯酶基因中KPC-2型最常見(13/13)，見圖3。取NDM-1陽性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為NDM-1 基因，與編碼CP028786.1序列100%同源，有5株細(xì)菌該基因陽性(5/13)，見圖4。未檢測(cè)到blaIMP、blaVIM、blaGIM基因。

圖1 部分改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Modified Hodge test results of partial strains

圖2 部分EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性結(jié)果Figure 2 Positive results of EDTA-disk synergy test of partial strains

注：M為DNA標(biāo)志物；Kp1—Kp13均為blaKPC基因陽性

注：M為DNA標(biāo)志物；Kp4、Kp8、Kp9、Kp10、Kp12為blaNDM-1基因陽性；Kp1—Kp3、Kp5—Kp7、Kp11、Kp13均為blaNDM-1基因陰性

2.5 PFGE分型及MLST結(jié)果 PFGE聚類結(jié)果顯示，以85%作為界值可將13株CRKP分為5種型別，分別為A、B、C、D、E型，主要為C型(9/13)，且均屬于ST11，其他型別為ST37、ST626、ST628和ST668，見圖5。eBURST軟件分析結(jié)果顯示檢出的ST11、ST37均屬于克隆復(fù)合體CC258群，見圖6。

圖5 13株CRKP的PFGE分型結(jié)果和MLST型別Figure 5 PFGE typing results and MLST of 13 strains of CRKP

注：紅色圓圈內(nèi)數(shù)值表示本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的ST類型；紅色方框內(nèi)表示克隆復(fù)合體CC258

3 討論

本研究中CRKP主要分離自各ICU及老年科病房，提示病情嚴(yán)重、體弱患者是主要的易感人群；這些菌株主要分離自痰，其次為尿，表明其主要定植在呼吸道，故應(yīng)加強(qiáng)可疑感染CRKP重癥患者的呼吸道細(xì)菌學(xué)檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)CRKP有助于臨床用藥及治療，提高患者生存率。

大量研究[4-6, 10]表明，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)：膜孔蛋白丟失，外排機(jī)制活躍，以及碳青霉烯酶的產(chǎn)生等，其中碳青霉烯酶(主要為KPC-2型碳青霉烯酶以及金屬β-內(nèi)酰胺酶)的產(chǎn)生是最主要的原因。然而，各地區(qū)間因抗菌藥物使用不同，耐藥基因的流行情況也存在一定差異。如張順等[11]對(duì)寧波地區(qū)分離的CRKP菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KPC-2與IMP-4是該地區(qū)此類菌株中分離出的主要碳青霉烯酶基因，未發(fā)現(xiàn)NDM-1基因。王建友等[12]報(bào)道，樂清市地區(qū)3年間分離的CRKP菌株中，69.2%的菌株攜帶KPC-2型碳青霉烯酶，12.5%攜帶NDM-1基因，28.3%的菌株同時(shí)攜帶KPC-2和IMP-4，耐藥基因呈多態(tài)性。而在北美地區(qū)[13]，除KPC-2和NDM-1碳青霉烯酶基因的檢出率占絕對(duì)主導(dǎo)外，OXA-48型碳青霉烯酶的檢出率也逐漸增高，但與國內(nèi)不同。

13株CRKP均產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶，說明KPC-2是該院肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南等藥物耐藥的主要原因；5株(38.46%)細(xì)菌產(chǎn)NDM-1，且該5株菌EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性，說明該試驗(yàn)對(duì)金屬酶檢測(cè)的高度特異性；部分菌株同時(shí)攜帶兩種碳青霉烯酶基因(KPC-2與NDM-1)，說明該院碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌中呈現(xiàn)多態(tài)性，這是造成該院CRKP廣泛流行的根本原因，但同時(shí)攜帶兩種碳青霉烯酶基因的菌株其耐藥性與其他菌株并無明顯差別，可能是因?yàn)椴糠只虿⑽幢磉_(dá)或僅存在低水平表達(dá)。

近年來，相關(guān)研究[3, 14-15]顯示，全球產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的序列型主要為ST258，在美國、以色列和意大利流行。而國內(nèi)學(xué)者俞云松等[16]研究發(fā)現(xiàn)ST11是我國的優(yōu)勢(shì)序列類型，ST11與ST258間只有一個(gè)管家基因(tonB)存在差別，同屬于克隆復(fù)合體CC258。

本次研究結(jié)果顯示該院流行的CRKP也以克隆類型ST11為主，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了ST37與ST628等，與國內(nèi)的相關(guān)報(bào)道[6-7, 17]一致。PFGE結(jié)果顯示，分離自不同病房的CRKP菌株(如Kp5與Kp10)具有100%的同源性(均為ST11)，提示該院的此類菌株在一段時(shí)間內(nèi)存在暴發(fā)流行現(xiàn)象，由于菌株采集時(shí)間不同，來源科室也不同，可能由于醫(yī)護(hù)人員的流通或患者住院科室的流轉(zhuǎn)，滯留在物體表面或空氣中的病原菌感染了其他患者，因此，臨床醫(yī)生應(yīng)注意手衛(wèi)生與醫(yī)院感染防控，應(yīng)對(duì)該院碳青霉烯酶基因進(jìn)行調(diào)查追蹤及分子流行病學(xué)的分析，有效掌控產(chǎn)不同碳青霉烯酶菌株的流行情況，為醫(yī)院感染進(jìn)一步的防控提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

CRKP在中國、希臘、美國的檢出率較高[1, 3, 18]，在曾經(jīng)分離率很低的歐洲國家也逐漸出現(xiàn)流行，對(duì)此類細(xì)菌的監(jiān)測(cè)在相關(guān)感染預(yù)防控制中仍是一項(xiàng)重要措施。盡管各國的醫(yī)療機(jī)構(gòu)、科研中心甚至包括政府部門都對(duì)CRKP予以高度關(guān)注，但其整體流行趨勢(shì)尚未得到有效控制，因此，深入分析研究本地區(qū)分離的CRKP對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制及流行病學(xué)特點(diǎn)，有助于進(jìn)一步實(shí)施有針對(duì)性的預(yù)防控制措施。