脂肪干細胞移植對大鼠腦缺血后微血管生成及MT1-MMP表達的影響

林小娟 唐 毅△ 陳建豪 鄭 偉 鄭智楷 楊凌杰

1) 福建省立醫院北院 福建省老年醫院 福建醫科大學教學醫院神經內科，福建 福州 350003 2)福建省立醫院康復科，福建 福州 350003

脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs) 是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。許多研究表明[1-2]ADSCs移植有利于腦缺血大鼠神經功能的康復。在這個過程中，血管新生對神經細胞的保護作用至關重要，尤其在新生血管的萌芽階段[3-5]。1994年，SATO等[6-8]第一次識別MT1-MMP，是第一種被鑒定錨定在細胞膜上的不可溶性的基質金屬蛋白酶，并發現它在血管新生中起著重要作用。MT1-MMP可以在缺血局部降解基底膜和細胞外基質的有效成分，并在血管穩定中起關鍵作用，同時其能減少滲漏并促進血管新生[9]。在體外實驗中，大量證據表明MT1-MMP可促進外周血管新生[10-13]，但在促進腦血管新生方面研究較少。本研究旨在建立穩定的大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，通過檢測ADSCs移植后大鼠腦組織血管的新生和MT1-MMP的表達，探討ADSCs移植對缺血性卒中后MT1-MMP相關性血管新生的影響。

1 材料與方法

1．1實驗動物和分組健康雄性清潔級大鼠，每只質量250～300 g，購自上海斯賴克公司，許可證號：SCXK滬2007-0005)。大鼠隨機分為3組，其中假手術組5只大鼠，MCAO組及ADSCs組各15只大鼠；各組按術后4 d、7 d、14 d不同時間點再分為3個亞組，每個亞組5只。

1．2大鼠MCAO模型制備制備MCAO大鼠模型參考改良Zea-Longa線栓法[14]，方法如下：將大鼠麻醉并固定于手術臺上，取頸部正中切口，逐步將右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)分離，先后在ECA和CCA近心端結扎，并于CCA近分叉處剪手術切口，插入線栓深度約18 mm，阻斷大腦中動脈的所有血液來源，扎緊備線，最后縫合皮膚切口。以同樣方法處理假手術組大鼠，但是不插入線栓。

1．3脂肪來源干細胞的分離、培養、純化與鑒定取健康清潔級的體質量為80～100 g的雄性SD大鼠，ADSC的分離、培養、擴增和傳代，用第3代經流式細胞術，鑒定證實為ADSC的細胞用于移植實驗。

1．4神經功能缺損評分造模后第4、7、14天，采用mNSS量表對各組大鼠進行神經功能評詁。mNSS評分包括運動、感覺、反射和平衡4部分，總分為0～18分，分值越大，神經功能缺損越嚴重。

1．5免疫組織化學法檢測各組大鼠FⅧ-R Ag標記陽性血管內皮細胞各組大鼠腦組織常規石蠟切片進行免疫組織化學法檢測。先后滴加RAG-1 Antiody (工作濃度約1：300)，兔抗人MT1-MMP抗體(工作濃度1：250)，4 ℃孵育過夜。次日標本復溫后，經清洗3次后，再先后滴加熒光二抗FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)，Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)；避光孵育1 h，室溫顯色，然后封片、鏡檢。

1．6 Western Blot檢測蛋白濃度按蛋白抽提試劑盒說明書提取各組大鼠腦組織蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣品電泳、轉膜、封閉，分別加入一抗：兔抗人MT1-MMP抗體(工作濃度1：500)，β-Actin(工作濃度約1：500)，加入二抗：辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(工作濃度1：2 000)，山羊抗小鼠IgG(H+L)(工作濃度1：3 000)重復洗滌3次后；ECL液顯色，成像。Image J軟件分析數據。

2 結果

2．1大鼠神經功能mNSS評分造模4 d后，ADSCs組mNSS評分與MCAO組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；造模后7 d、14 d，ADSCs組mNSS評分優于同期MCAO組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠神經功能mNSS評分結果分)Table 1 Results of mNSS score of nerve function in

2．2大鼠缺血周邊區新生血管密度(MVD)分析激光共聚焦顯微鏡顯示，腦缺血大鼠梗死周邊區散在分布FⅧ-R Ag標記的血管內皮細胞(圖1)，術后4 d，MCAO組腦缺血大鼠梗死周邊區可見微血管新生，于術后7 d、14 d達高峰；而在相應的各時間點，ADSCs組較MCAO組微血管新生現象更為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 ADSCs移植后4 d、7 d、14 d，MCAO大鼠腦缺血周邊區可見大量FⅧ-R Ag標記陽性血管(標尺=100 μm)Figure 1 4 d，7 d and 14 d after ADSCs transplantation，a large number of ADSCs can be seen in the peripheral area of cerebral ischemia in MCAO rats FⅧ-R Ag markers positive blood vessels(ruler =100 μm)

表2 各組腦組織中缺血周邊區MVD分析Table 2 MVD analysis of peripheral ischemia in brain tissue of each

2．3大鼠腦缺血周邊區MT1-MMP的蛋白表達假手術組中MT1-MMP均呈低水平表達。MCAO組術后4 d可見MT1-MMP表達水平升高，術后7 d表達水平達高峰，而14 d時表達水平有所下降。ADSCs組中，MT1-MMP表達水平在各時間點有同樣的趨勢；移植術后4 d、7 d，MCAO組MT1-MMP表達水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。移植術后14 d，2組表達水平無顯著差異。此外可見缺血區MT1-MMP的蛋白表達變化。見圖3。通過雙重熒光免疫組化標記，在腦缺血大鼠梗死周邊區，在新生的微血管內皮細胞上可見MT1-MMP及Ⅷ因子共表達(圖4)。

3 討論

ADSCs是ZUK等[15]于2001年首次從人的脂肪組織中抽取而后懸液中分離獲得，相對于其他干細胞，具有易于取材、分離容易、能逃避免疫排斥反應等諸多優點，脂肪來源干細胞已成為極具前景的種子細胞之一[16-19]。研究表明[20]，脂肪干細胞能促進缺血性卒中大鼠梗死區血管新生。其中的機制可能通過上調VEGF和bFGF的表達[21]，促進血管新生；也可以通過Notch1-Dll4信號通路，提高Notch1受體及Dll4配體在血管內皮細胞上的表達，促進微血管生成，從而起到對腦缺血大鼠的腦保護作用。

表3 各組中缺血腦組織周邊區MT1-MMP的蛋白表達Table 3 Protein expression of mt1-mmp in peripheral areas of ischemic brain tissue in each

圖2 各組中MT1-MMP的蛋白表達Figure 2 Protein expression of MT1-MMP in each group

圖3 ADSCs移植后4 d、7 d、14 d MT1-MMP在大鼠腦部的表達Figure 3 Expression of MT1-MMP in the brain of rats 4 d，7 d and 14 d after ADSCs transplantation

圖4 MT1-MMP與FⅧ-R Ag標記新生血管共表達在微血管內皮細胞上Figure 4 MT1-MMP and FⅧ-R Ag marked the co-expression of neovascularization in microvascular endothelial cells

MT1MMP在血管損傷時，負責降解內皮細胞外基質，參與內皮細胞的遷徙及歸巢等[22-25]，并重塑血管內皮細胞[26-28]。通過細胞間環境的修飾，MT1-MMP可以使血管內皮細胞或黏附分子信號轉導發生改變，從而影響內皮細胞的功能，繼而促進血管新生[29-32]。相關研究表明，MT1-MMP基因沉默動物模型可見到血管新生抑制現象[33-34]，提示MT1-MMP對血管新生的影響。而ADSCs移植是否通過調節MT1-MMP促進腦血管新生，目前研究較少。許多研究證實，FⅧ-RAg是直接反映血管新生的指標，其標記血管內皮細胞的特異性和敏感性均很強；通過MT1-MMP與FⅧ-RAg的共同標記，可證明MT1-MMP對血管新生的影響。

本次試驗成功建立了MCAO大鼠模型，并移植ADSCs。相比MCAO組及ADSCs組，造模后4d，神經功能康復比較無明顯差異；在7d、14d，ADSCs組較MCAO組神經功能康復明顯改善。大鼠腦缺血周邊區域，我們觀察到ADSCs組腦缺血周邊區微血管新生，且較MCAO組顯著增多，證實ADSCs移植確能促進血管新生；在雙重免疫熒光標記后，我們發現在腦缺血大鼠梗死區新生內皮細胞上FⅧ-RAg與MT1-MMP共表達，提示MT1-MMP參與了大鼠腦缺血后梗死周邊區血管新生。通過Western-blot印跡分析，在術后4d，MCAO組可見MT1-MMP表達升高，術后7d達到高峰；而ADSCs組較MCAO組MT1-MMP表達水平明顯升高；提示ADSCs移植可促進大鼠梗死周邊區MT1-MMP表達的作用；在術后14d時，MT1-MMP表達水平無明顯升高，提示MT1-MMP可能在血管新生早期萌芽階段起作用，這與以往的研究結果相符合[35-38]。因而考慮ADSCs移植的腦保護作用可能部分是通過MT1-MMP的表達上調，從而促進血管新生，特別在早期血管新生階段，最終保護神經細胞，促進神經功能康復。

ADSCs移植后能夠促進MT1-MMP在腦缺血大鼠梗死周邊區新生血管內皮細胞上的表達，從而促進血管新生，保護神經細胞，最終達到神經功能康復。