高海拔地區珠子參居群葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量的變化△

左應梅，許宗亮，楊維澤，楊紹兵，楊天梅，楊美權，張金渝

(云南省農業科學院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

珠子參PanaxjaponicusC.A.Meyer varmajor(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng)又名扣子七，屬五加科人參屬植物，其根莖為藥材珠子參，具有活血散瘀，補血止血，消腫止痛等類似三七的功效。珠子參主要分布在陜西、四川、云南、湖北、甘肅、貴州、西藏等地，是秦巴山區特色中藥材“太白七藥”之一，現代藥理實驗證明其具有提高免疫功能、增強造血功能、抗腫瘤、抗心律不齊及抗炎等作用[1]。目前，珠子參的研究主要集中在資源分布、化學成分、藥理作用、臨床應用及分子生物信息學等方面[2-7]。有關生理生態特性方面的研究較少，左應梅等研究表明，相同栽培條件下珠子參不同居群的光合特性、保護酶活性、丙二醛含量(MDA)和葉綠素含量存在一定差異[8]；黃文靜等研究表明，三年生珠子參地上部分生長旺盛，葉綠素含量和保護酶活性較高，對光能的捕獲、有機物的同化、以及對環境的適應能力高于二年生和苗期珠子參[9]；30%遮陰處理下珠子參株高、主莖粗、果實數、根莖直徑、葉綠素含量、SOD和POD活性增加，地下根莖節間長度和葉片MDA含量減小[10]。而珠子參對海拔高低的生理響應和自身抗氧化適應方面的研究鮮見報道。

本研究擬通過測定20個居群珠子參的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，探討各類居群的CAT、POD和SOD活性和MDA含量隨海拔梯度的變化規律，探明珠子參不同類群的抗氧化能力對海拔的響應特性，為珠子參的野生馴化、優良品種的選育及栽培的生態適應性提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究材料共20個居群珠子參，其采集地點及地理位置見表1。采樣時間為2016年7月～8月。每個采樣點采取具有代表性的10個植株，所采植株大小基本一致，地下根莖個數為5～6個的代表性正常成熟植株。將葉片裝于自封袋，密封后迅速放入-80 ℃液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 保護酶活性測定

酶液提取參照高俊鳳的方法[11]，略有改進，即稱取新鮮珠子參葉片約0.5 g于預冷的研缽中，加適量預冷的0.05 mol·L-1(pH 7.8)磷酸緩沖液、少量石英砂和聚乙烯吡咯烷酮于冰浴上研磨成漿，轉移到刻度離心管，用磷酸緩沖液沖洗研缽2～3次，使終體積為8 mL。將提取液在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，上清液用于CAT、POD、SOD活性測定及MDA含量測定。

SOD總活性采用NBT(淡藍四唑)光還原法測定，以抑制NBT光還原反應50%所需的酶量為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW表示；POD活性采用愈刨木酚顯色法測定，以每分鐘OD470變化0.01為一個過氧化物酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW·min-1；CAT活性采用紫外吸收法測定以1 min內OD240降低0.01為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1FW·min-1表示[11]。

1.2.2 丙二醛含量性測定

MDA含量測定參照Zhang和Kirkham[12]的方法。取上述酶提取液1.5 mL，加入2.5 mL0.5%的硫代巴比妥酸(用5%三氯乙酸配制)，沸水中加熱20 min，冰浴速冷，離心，取上清液于分光光度計上分別測定450、532和600 nm處的吸光值，計算MDA含量，含量以nmol·g-1FW表示。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2007軟件對數據進行處理和繪圖，采用JMP7統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗(Tukey法)。

2 結果與分析

2.1 不同居群保護酶活性和丙二醛含量比較

由表2可知，CAT活性最大的是居群1，最小的是居群8。居群1的CAT活性顯著大于居群2、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17；居群3、4、7、13、18、19和20(前)之間的CAT活性差異不顯著，居群5、6、8、9、10、11、14、15、16和17(后)之間的CAT活性差異不顯著，但前面一組的CAT活性顯著大于后面一組。POD活性最大的是居群1，最小的是居群6。居群1的POD活性除了與居群8、12間的差異不顯著，與其余居群間的差異均達顯著水平；居群2、3、13、14、15、16、17、19(前)間的POD活性差異不顯著，居群4、5、6、7、9、10、11、18、20(后)間的POD活性差異不顯著，其中前一組居群的POD活性顯著大于后一組的居群6、7和9。SOD活性最大的是居群13，最小的是居群17。居群13的SOD活性顯著大于居群9和17，與其余居群間的差異均不顯著。MDA的含量最大的是居群15，最小的是居群4。居群15的MDA含量顯著大于居群4和7，與其余居群間的差異均不顯著。由此可見，20個居群珠子參的保護酶活性和丙二醛含量存在一定差異，可能與其生長的海拔高度等因素有關。

注：采用JMP7統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗(Tukey法)，同行數據后不同字母表示差異具有統計學意義，P<0.05。

2.2 聚類分析

從以上分析可知，20個居群珠子參的保護酶活性和丙二醛含量存在一定差異。我們根據CAT、POD、SOD活性和MDA含量對20個珠子參居群進行聚類分析(Ward法)，當距離為1.64時分為3類(圖1)。第Ⅰ類包括1、3、9、18、4和7，共計6個居群；第Ⅱ類包括2、5、10、19、20和14，共計6個居群；第Ⅲ類包括6、12、13、11、16、17、8和15，共計8個居群。

2.3 各類居群的保護酶活性和丙二醛含量

為了比較各類居群的保護酶活性和丙二醛含量的差異，對CAT、POD、SOD活性和MDA含量的均值分別進行差異顯著性檢驗。由表3可知，POD和SOD活性在各類居群間的差異不顯著；第Ⅰ類居群的CAT活性分別是第Ⅱ、Ⅲ類居群的1.45倍和1.74倍，其中第Ⅰ類的顯著大于第Ⅲ類的；第Ⅲ類居群的MDA含量分別是第Ⅰ、Ⅱ類的2.28倍和1.52倍，三者間的差異達顯著水平。

圖1 20個居群珠子參的聚類分析樹狀圖

注：采用JMP7統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗(Tukey法)，同行數據后不同字母表示差異具有統計學意義，P< 0.05。

2.4 各類居群的保護酶活性和丙二醛含量與海拔高度間的關系

為了探討各類居群的保護酶活性和丙二醛含量與海拔高度間的關系，將各類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量分別與海拔高度進行分析，結果如圖2、3、4。由圖2-A，B，C 可以看出在海拔2600～3600 m范圍內，第Ⅰ類居群的CAT、POD和SOD活性，隨著海拔的升高呈二次凹函數關系，相關系數r分別為0.639 6、0.597 1和0.634 4；MDA含量與海拔高度間相關性較差(圖2-D)。由圖3-A，B，C，D可以看出，在海拔2600～3600 m范圍內，第Ⅱ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量與海拔高度無相關性。由圖4-A，C可以看出，在海拔2600～3600 m范圍內，CAT和SOD活性與海拔呈正相關關系，相關系數r分別為0.377 9和0.526 2；POD活性與海拔呈負相關關系，相關系數r為0.506 9；(圖4-B)；MDA含量與海拔高度間無相關性(圖4-D)。

3 討論與結論

圖2 第Ⅰ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔高度的變化情況

圖3 第Ⅱ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔的變化

圖4 第Ⅲ類居群的CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔的變化

各種逆境對植物體的傷害大多與植物體內自由基代謝平衡有關。逆境能引起植物體內活性氧代謝紊亂，從而引起自由基的積累和膜脂過氧化，使膜系統的結構和功能受到損傷，造成植物細胞傷害，其中表現之一就是細胞中MDA含量的增加[13]。相應地植物體內也形成復雜的抗氧化系統，保護植物免受活性氧傷害[14-16]。SOD被認為是植物體內氧代謝的關鍵酶，它的活力變化直接影響植物體內O2-與H2O2的含量；POD是活性較高的適應性酶，是細胞中降解活性氧(ROS)的保護酶復合物的一員，其主要作用是清除H2O2以保護細胞；CAT主要存在于植物的過氧化物體(或乙醛酸循環體)中，主要功能是清除光呼吸或脂肪酸β-氧化過程中形成的H2O2。活性氧的清除涉及一系列細胞代謝和酶促反應過程，由非酶保護系統和酶保護系統的成員協同作用使細胞內的活性氧維持在較低水平，確保植物正常生長和代謝[17]。SOD、POD和CAT是保護酶系統的主要酶，SOD、POD和CAT協同作用可降低其對膜脂的攻擊，其活性的高低可反映植物對環境條件適應能力的強弱[18-21]。

在經緯度和海拔等自然梯度上，氣候、植被和土壤等環境因子具有明顯的和系統性的變化規律。其中，海拔梯度是一復合梯度，海拔高低不同，有可能造成不同地區光、溫、水、氣、肥的巨大差別，從而影響植物生長[22]。Wildi和Lütz認為，植物體內保護物質對海拔的變化有著各自不同的響應模式[23]。

本研究從珠子參的保護酶活性和膜質過氧化水平對20個居群珠子參進行聚類分析，然后分析各類居群對海拔梯度的響應特性。結果表明，20個居群珠子參可分為3個類群，隨著海拔高度的升高，各類居群的保護酶活性和丙二醛含量表現出不同的響應特性。第Ⅰ類居群的保護酶CAT、POD和SOD活性隨著海拔的升高呈現“高-低-高”的變化趨勢。這表明當海拔相對較低時，珠子參植株體內CAT、POD和SOD活性增強，能有效地清除體內由生態因子脅迫而產生的活性氧，保護細胞免受傷害。隨著海拔升高，生態條件適合珠子參生長而改變代謝途徑使產生的活性氧自由基降低，CAT、POD和SOD活性也隨之降低，說明該類居群珠子參植株具有性喜冷涼的生物學特性。當海拔較高時，CAT、POD和SOD活性又呈增強的趨勢，這可能是由于在高海拔條件下溫度下降，較低的土壤溫度影響了珠子參植物根系對土壤水分的吸收能力，受到了較嚴重的水分脅迫等不利因素的影響，抗逆酶活性誘導增強，這與陳曉莉等在祁連圓柏上的研究結果類似[24]。在海拔2600～3600 m范圍內，隨著海拔的升高，CAT、POD、SOD活性表現出相同的變化趨勢，這表明三種抗氧化酶具有較強的協同作用關系，能及時有效地清除由于海拔改變而產生的活性氧自由基，使得MDA含量保持在較低水平，三個抗氧化保護酶的協同作用與該類居群的抗逆性和對環境的適應性密切相關，可能是珠子參居群適應環境脅迫的重要生理機制之一。第Ⅱ類居群，隨著海拔的升高，CAT、POD、SOD活性和MDA含量隨海拔高度變化的規律不明顯，這表明在海拔2600～3600 m范圍內，由于生態因子變化并未使得該類居群的保護酶活性等方面發生明顯變化，海拔可能不是最主要的影響因子。第Ⅲ類居群，在海拔2600～3600 m范圍內，CAT和SOD活性與海拔高度呈正相關關系，POD活性與海拔高度呈負相關關系；MDA含量隨海拔高度變化的規律不明顯，但其含量顯著大于第Ⅰ和Ⅱ類居群。這表明，隨著海拔的升高該類居群的CAT、SOD的活性有一定的增加，但CAT活性顯著小于第Ⅰ類居群，POD活性下降，三種抗氧化酶系統的協同作用小，對清除活性氧自由基的作用減弱，因此膜質過氧化程度較高，生態適應性差。

綜合本次研究表明，隨著海拔的升高，3類居群珠子參植株對由海拔引起的生態因子變化的適應能力不同，第Ⅰ類居群的膜質過氧化程度最低，生態適應性較好；第Ⅲ類的膜質過氧化程度最高，生態適應性較差。保護酶CAT、POD和SOD活性隨著海拔的升高也表現出不同的響應特性，因此，從抗氧化系統和膜質過氧化水平角度對珠子參居群進行分類，并研究各類居群對海拔變化的響應特性，探討其生態適應性機制，可為珠子參的引種馴化和栽培的生態適應性提供理論參考。此外，20個居群珠子參的生理特征并沒有完全依地理距離而聚類，即珠子參居群間生理特征的變異存在不連續性，這可能是生活在不同生境中的珠子參在形態等方面發生了適應性變化，在生理特征方面也同樣發生了變異，這與麻櫟不同種源表型性狀聚類分析的結果與其種源地理分布的相關性不明顯[25]與云南含笑6個天然居群的表型性狀并沒有嚴格依地理距離而聚類[26]的研究結果類似。