6種中藥材黃曲霉毒素B1快速檢測方法研究△

李細芬，毛雯雯，張雅琴，馮紅，許宏亮，李彥川，蔡瑩瀛，張蘭蘭

(數字本草檢測有限公司，天津 300400)

中藥材容易受到黃曲霉毒素的污染已是不爭的事實，相應地，中藥材黃曲霉毒素檢測方法也成為目前的研究熱點，已有較多文獻報道[1-7]。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要為高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法。液相色譜法為常規檢測方法，液相色譜-質譜聯用法一般為確證方法[8]。兩種方法特異性強、靈敏度高、定量準確，但步驟繁瑣，耗時費力，成本高昂，不利于中藥材黃曲霉毒素的快速檢測，尤其是缺乏實驗條件的藥材集散地、種植粗加工產地難以廣泛普及。因此，急需開發一種成本低廉、方便快捷、簡單易學的檢測方法，以便于對中藥材黃曲霉毒素進行隨時隨地檢測。

膠體金法，又稱膠體金免疫層析法(Gold immunochromatography assay，GICA)，是一種將膠體金標記技術、免疫技術和固相層析技術等多種方法有機結合在一起的檢測技術。膠體金法以其簡單快速、結果直觀、成本低廉的顯著優勢，在醫學檢驗、食品安全等領域應用較為廣泛。由于中藥材成分復雜，基質干擾嚴重，在中藥材檢測中應用較少，僅有少量文獻報道。林方芬[9]等應用膠體金方法檢測中藥飲片，結果與ELISA方法一致；李輝[10]考察了中藥材對膠體金檢測方法的基質影響，提出中藥成分中不含黃曲霉毒素結構類似物香豆素類成分的藥材對本法檢測結果影響較小。以上研究均未對膠體金方法檢測酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、決明子和遠志6種中藥材的前處理方法進行詳細報道，本研究旨在通過對6種中藥材前處理方法進行研究，建立酸棗仁等6種中藥材的膠體金快速檢測方法，為膠體金方法應用到更多中藥材黃曲霉毒素的快速檢測提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀；Agilent G1321A FLD檢測器；Aura U.S.A光化學衍生器；Agilent Zorbax C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；湘儀H1850型離心機；Sartorius QUINTIX224-1CN分析天平；超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與材料

黃曲霉毒素對照品，具體信息見表1。分析甲醇(天津康科德化學試劑公司)；色譜甲醇(德國默克公司)，黃曲霉毒素B1膠體金檢測卡(本公司自己生產，批號20160831)；黃曲霉素總量免疫親和柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)；酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、決明子和遠志藥材樣品，均購自河北省保定市安國藥材市場。

2 實驗方法

2.1 中藥材黃曲霉毒素B1膠體金快速檢測方法

中藥材品種間基質差異較大，對膠體金中抗原抗體反應以及膠體金顯色的影響不一，因此需對藥材的前處理方法分別進行研究。

2.1.1酸棗仁、蓮子、薏苡仁前處理方法 稱取用液相方法檢測不含黃曲霉毒素的酸棗仁、蓮子和桃仁樣品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黃曲霉毒素B1對照品溶液，制成含黃曲霉毒素B10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的樣品，加5 mL 70%甲醇(含氯化鈉4%)，渦旋3 min，離心，取上清500 μL于蒸發皿中，置水浴上揮干，再加1000 μL PBS復溶，得樣品檢測液。取樣品檢測液100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結果。

2.1.2決明子、檳榔和遠志樣品前處理方法 稱取用液相方法檢測不含黃曲霉毒品素的檳榔、決明子和遠志樣品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)對照品溶液，制成含AFB10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的樣品，加5 mL 70%甲醇(含氯化鈉4%)，渦旋3 min，離心，取1 mL上清液，加入4 mL水進行稀釋，取稀釋后溶液5 mL過免疫親和柱。過柱方法：5 mL上樣，5 mL水洗，1 mL甲醇洗脫。取500 μL洗脫液揮干，加1000 μL 2%BSA/PBS復溶，得樣品樣測液。取樣品檢測液100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結果。

2.1.3膠體金快檢方法特異性考察 以酸棗仁樣品為例，將AFB1標準溶液添加到陰性酸棗仁粉末中，制備成5、10、20 μg·kg-1系列濃度，再依法制備AFB2、AFG1、AFG2系列濃度樣品，按“2.1.1法”處理，每濃度取100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結果。

2.1.4膠體金法檢測樣品重復性考察 取“2.1.1法”中添加2.5和7.5 μg·kg-1的酸棗仁樣品，按“2.1.1法”處理，每個濃度重復檢測10次，觀察膠體金檢測卡的重復性。

2.2 中藥材黃曲霉毒素液相色譜檢測方法

2.2.1對照品溶液的制備 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對照品溶液配制：分別將對照品全部轉移至適當容積的容量瓶中，用甲醇洗滌2～3次，一并轉移至同一容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得。

混合對照品貯備溶液的配制：分別精密吸取黃曲霉毒素4種標準溶液適量至適當容量瓶中，用70%甲醇定容，最后得AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃度分別為40、12、40、12 ng·mL-1。

混合對照品溶液的制備：精密量取上述混合對照品貯備溶液，用70%甲醇制成每1 mL分別含AFB1、AFG12.5、5、10、20、40 ng；AFB2、AFG20.75、1.5、3、6、12 ng的溶液，即得。

2.2.2 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；FLD熒光檢測器，激發波長=360 nm，發射波長=440 nm；流動相：甲醇-水(45∶55)，等度洗脫；柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進樣量50 μL。兩個相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。

2.2.3黃曲霉毒素標準曲線繪制 將黃曲霉毒素標準溶液系列濃度，依次進樣檢測。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.2.4供試品溶液制備 取藥材樣品粉末(過二號篩)約15 g，精密稱定，置于均質器中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2分鐘(攪拌速度大于11000 r·min-1)，離心5分鐘(離心速度2500 r·min-1)，過濾，精密取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，量取續濾液20.0 mL，通過免疫親和柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用1.5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用純水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.5 HPLC方法學考察 (1)線性范圍：精密吸取上述不同濃度的混合對照品溶液，按2.2.2色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標，對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線并計算線性范圍。(2)精密度：取“(1)線性范圍”項下，AFB1、AFG1濃度為10 ng·mL-1，AFB2、AFG2濃度為3 ng·mL-1的混合對照品溶液，按照2.2.2項下的色譜條件進行分析，一天內連續進樣6次，連續進樣兩天，分別記錄AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面積，計算日內和日間RSD值。(3)重復性：取陽性蓮子樣品做重復性試驗。按2.2.4藥材供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，并按2.2.2色譜條件進行分析。(4)回收率：取陰性薏苡仁樣品做回收率試驗。AFB1、AFG1的添加水平為10 μg·kg-1，AFB2、AFG2的添加水平為3 μg·kg-1。按2.2.4供試品溶液制備方法，精密添加一定量的標準品溶液，平行制備6份供試品溶液，并按2.2.2色譜條件進行分析，計算回收率。(5)檢測項與定量限：根據信噪比S/N=3和S/N=10確定目標物的檢出限和定量限。

2.3 中藥材樣品快檢結果與液相結果驗證

收集酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、遠志，決明子樣品若干份，分別按2.1.1和2.1.2方法用膠體金試紙條檢測，獲得快檢結果；同時按2.2.4方法進行HPLC檢測，獲得液相結果；將兩種方法檢測結果進行對比，判斷兩種方法的符合率。

3 結果與分析

3.1 膠體金快速檢測方法考察結果

3.1.1 酸棗仁、蓮子、薏苡仁樣品膠體金快速檢測基質干擾與靈敏度 酸棗仁樣品添加AFB1標準品后經膠體金檢測卡檢測，檢測線(T線)0和2.5 μg·kg-1顯色，5和7.5 μg·kg-1濃度不顯色，結果如圖1，即5 μg·kg-1消線。通過實驗發現，蓮子和薏苡仁基質干擾與酸棗仁相似，可用同一種方法消除，結果同圖1。因此，本膠體金檢測卡檢測酸棗仁、蓮子和薏苡仁樣品的靈敏度為5 μg·kg-1，大于5 μg·kg-1的樣品均不顯色，為陽性。

圖1 酸棗仁快檢方法靈敏度試驗結果

3.1.2 決明子、檳榔和遠志樣品膠體金快速檢測基質干擾與靈敏度 決明子、檳榔和遠志藥材色素較重，未經凈化滴加在膠體金檢測卡上，背景很深，影響檢測線的顯色。因而無法檢測，如圖2。決明子和遠志藥材情況類似，圖略。決明子等3種藥材添加系列黃曲霉標準品后，按方法2.1.2操作，將樣品提取液通過免疫親和柱凈化，凈化后樣品檢測液色素明顯減輕，從而消除了色素干擾，0和2.5 μg·kg-1濃度顯色，5和7.5 μg·kg-1濃度不顯色，即5 μg·kg-1消線，大于5 μg·kg-1的樣品均不顯色，為陽性。結果同圖1。因此，本膠體金檢測卡檢測遠志、決明子和檳榔樣品的靈敏度為5 μg·kg-1。

3.1.3膠體金法檢測樣品特異性 對添加系列濃度黃曲霉毒素的酸棗仁樣品用膠體金檢測卡進行檢測，結果顯示AFB15～20 μg·kg-1均呈顯著抑制，T線不顯色，結果如圖3。對AFB25～20 μg·kg-1均無抑制，T線均顯色，結果如圖4，AFG1、AFG2反應結果與AFB2相同，均無抑制，圖略。說明本膠體金試紙條對AFB1有特異性，只識別黃曲霉毒素B1，而與其他3種黃曲霉毒素無交叉反應。

圖2 檳榔樣品過柱前后檢測結果

圖3 膠體金法對B1檢測結果圖

圖4 膠體金法對B2檢測結果

3.1.4膠體金法檢測樣品重復性 用膠體金檢測卡檢測2.5和7.5 μg·kg-1兩個濃度酸棗仁樣品，每個濃度重復10次，結果顯示2.5 μg·kg-1濃度均顯色，為陰性，且顯色一致性較好，如圖5；7.5 μg·kg-1濃度均不顯色，為陽性。結果如圖6。

圖5 膠體金法檢測2.5 μg·kg-1濃度重復性結果

圖6 膠體金法檢測7.5 μg·kg-1濃度重復性結果

3.2 黃曲霉毒素液相檢測方法考察

3.2.1黃曲霉毒素HPLC標準曲線和線性范圍 精密吸取不同濃度的混合對照品溶液，進行液相分析。黃曲霉毒素標準品色譜圖見圖7。相鄰色譜峰之間的分離度分別為3.15、2.24、2.08。

以峰面積為縱坐標，對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線并計算線性范圍。結果顯示對照品濃度與峰面積呈現良好的線性關系，r≥0.999，結果見圖8。黃曲霉毒素B1、G1在2.5～40 ng·mL-1，黃曲霉毒素B2、G2在0.75～12 ng·mL-1范圍內線性良好。

圖7 4種黃曲霉毒素HPLC圖

3.2.2 黃曲霉毒素HPLC精密度 同一濃度黃曲霉毒素混合對照品溶液，一天內連續進樣6次，連續進樣兩天，計算日內和日間峰面積的相對標準偏差(RSD)。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2日內精密度RSD分別為1.17%、1.62%、2.69%、2.52%；日間精密度RSD分別為1.66%、1.26%、2.69%、2.62%。

由此可見，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的日內和日間峰面積RSD均小于3%，表明方法精密度良好。

圖8 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準曲線

3.2.3黃曲霉毒素HPLC重復性 取陽性蓮子樣品平行檢測6份得出重復性結果。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的計算結果RSD分別為4.85%、6.74%、3.04%、7.30%，均小于8%，說明黃曲霉HPLC法重復性良好。

3.2.4黃曲霉毒素HPLC回收率 對添加了黃曲霉毒素標準品的薏苡仁陰性樣品按2.2供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液進行液相色譜法檢測。回收率結果見表2，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的回收率在87.9%～98.0%之間，RSD均小于5.0%。

3.3 快檢方法與液相方法比對

收集酸棗仁樣品20批、蓮子15批、薏苡仁19批、檳榔17批，遠志20批、決明子20批，共計111批次，同時用膠體金快檢方法和液相色譜法進行檢測。檢測結果見表3。111批次樣本中109批次檢測結果與液相結果相符，快檢方法的判斷準確率為98.2%。其中出現2例與液相結果不符合的情況，檳榔B006號、遠志Y001號液相結果分別為4.5 μg·kg-1和3.4 μg·kg-1，而膠體金快檢方法判斷為陽性(為黃曲霉毒素B1超標，可能為樣品中的黃曲霉毒素含量較為接近藥典標準5 μg·kg-1，從而出現誤判。因此，快檢方法適合黃曲霉毒素的初篩性檢查，如遇可疑結果還需用藥典標準方法進行確證。

4 討論

對本公司檢測數據及文獻報道[11-12]分析，選擇酸棗仁、薏苡仁、蓮子、決明子、檳榔和遠志6種黃曲霉毒素污染率高的藥材進行膠體金快檢方法摸索。6種藥材基質不同，需采用不同的前處理方法消除基質影響。

酸棗仁、薏苡仁和蓮子基質影響相對較少，通過70%甲醇提取、離心，上清液揮干，除掉提取液中有機溶劑甲醇，再用PBS緩沖溶液復溶，復溶后溶液較為澄清，基本為無色，用膠體金檢測卡進行檢測時，膠體金顯色基本不受基質干擾，零濃度顯色清晰，隨著樣品中黃曲霉毒素濃度的增加，顯色逐漸變淺，直至不顯色。這是由于黃曲霉毒素膠體金法采用的是免疫競爭原理，樣品中黃曲霉毒素的濃度與試紙條上檢測線的顏色呈反相關。當樣品中的黃曲霉毒素濃度達到5 μg·kg-1及以上時，檢測線完全被抑制不顯色，為陽性結果；低于5 μg·kg-1，檢測線顯色，為陰性。這種判斷符合《中華人民共和國藥典》規定的限量標準，因此可用于對酸棗仁、薏苡仁和蓮子中的黃曲霉毒素B1進行初篩性檢測。

表3 111批次樣品兩種方法檢測結果

注：表中“+”表示超過藥典規定標準，“-”表示未超過藥典規定標準。

檳榔、遠志和決明子用甲醇提取后，色素過重，僅用揮干有機溶劑的方法不能消除色素等基質的影響。因此，需采用一定的凈化方法，將提取物中的色素等其他雜質清除或降低。黃曲霉毒素免疫親和柱凈化是目前較好的凈化方法，它采用的是特異性抗原抗體結合原理，不能與親和柱中包埋的黃曲霉毒素抗體結合的雜質流出柱子，只有黃曲霉毒素能結合在柱體上，再用甲醇進行洗脫，從而實現目標物與雜質的分離，有效消除了基質影響。膠體金法樣品需要量少，只需取1mL提取液過柱凈化，節省了實驗時間，實現了檳榔、遠志和決明子的快速檢測，整個樣品檢測30 min內可完成。

液相色譜法檢測黃曲霉毒素一般有多種流動相系統：甲醇-水[13]，甲醇-乙腈-水[14]，乙腈-水[15]，需根據實驗室液相色譜系統進行選擇優化。本實驗室液相色譜系統選用甲醇-水(45∶55)作流動相，取得了較好效果，4種黃曲霉毒素分離度均在1.5以上，精密性、回收率和重復性良好，檢測一個樣品約需5 h完成。而快檢方法只需要30 min即可完成，大大提高了樣品的檢測效率。快檢方法使用過程中無需使用黃曲霉毒素標準品，只需膠體金檢測卡和少量試劑即可完成，安全、環保、省時、省力、省成本，無需專業人員、可用于大量樣本的快速篩查和現場及時篩查。

本文對2015版《中華人民共和國藥典》中規定的19種藥材中的6種進行了快檢研究，其它藥材的快檢有待今后繼續研究。