HPLC定量分析千斤拔藥材中染料木苷和染料木素的含量△

張鵬，彭開鋒，李伏君，龔云，劉逆夫，付卡利，楊秀偉，王龍

(1.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412000；2.北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；3.約翰霍普金斯大學，美國 巴爾的摩 21218)

婦科千金片和婦科千金膠囊是收載于《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2015版一部的現代中藥復方制劑，具有清熱除濕、益氣化瘀之功效；用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力，慢性盆腔炎、子宮內膜炎、慢性宮頸炎見上述證候者。組方藥味包括千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當歸、雞血藤和黨參[1]。君藥千斤拔，《中國藥典》2015版四部收載的基原植物有蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.et Rolfe) Li、大葉千斤拔M.macrophylla(Willd.) O.Kuntze和銹毛千斤拔M.ferruginea(Wall.ex Benth.) Li.[2]。千斤拔性溫，味甘、辛，民間多用于治療風濕骨痛、慢性腎炎、跌打損傷、白帶多和痛經等[3-5]。已有研究表明，千斤拔含有大量的黃酮類化合物[6-9]，其中的染料木苷(genistin)和染料木素(genistein)具有顯著的抗氧化、類激素、抗菌、抗癌和保護心血管等作用[10-12]。而有關以千斤拔作為君藥的中成藥婦科千金片、婦科千金膠囊、金雞膠囊等治療婦科疾病和風濕病的作用基礎，正是該味藥中起激素作用和抗炎、抗氧化作用的化學成分。因此，本研究選取染料木苷和染料木素2個活性成分作為含量測定的指標，建立測定方法，為評價該藥材質量優劣提供方法學。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司]，AB204-S型十萬分之一電子分析天平(德國梅特勒-托利多儀器有限公司)，KQ5200DE型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，FZ102微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑和試藥

對照品染料木苷(供含量測定用，批號：111709-201702)和染料木素(供含量測定用，批號：111704-201302)購于中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈(美國Merck公司)，分析純甲醇和乙酸乙酯(天津市科密歐化學試劑有限公司)，分析純三氯甲烷(天津市富宇精細化工有限公司)，分析純冰醋酸和磷酸(湖南匯虹試劑有限公司)。

9批次千斤拔樣品信息見表1，經株洲千金藥業股份有限公司劉逆夫副教授分別鑒定為蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.et Rolfe) Li和大葉千斤拔M.macrophylla(Willd.) O.Kuntze的根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序見表2，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL；理論塔板數以染料木苷和染料木素計，不低于5000；分離度以染料木苷和染料木素計算，大于1.50。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取染料木苷對照品約17.5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成699.3 μg·mL-1的染料木苷對照品貯備溶液；精密稱取染料木素對照品約16.5 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 635.15 μg·mL-1的染料木素對照品貯備溶液。

分別精密量取對照品貯備液，染料木苷20 mL和染料木素2 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成染料木苷質量濃度為559.44 μg·mL-1和染料木素質量濃度為130.81 μg·mL-1的混合對照品溶液。

將混合對照品溶液精密稀釋成染料木苷質量濃度分別為17.483、34.965、69.930、139.860、279.720 μg·mL-1，染料木素質量濃度分別為4.088、8.176、16.352、32.703、65.406 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取大葉千斤拔藥材粉末(過40目篩)5.00 g，加入50%乙醇水溶液75 mL，稱定質量，于水浴中在85 ℃回流提取1 h，取出，放冷，再稱定質量，用50%乙醇水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.3 專屬性試驗

分別吸取對照品和供試品溶液，按2.1色譜條件測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果表明，供試品色譜圖中，具有與對照品溶液色譜圖中相同保留時間的色譜峰，供試品中分析物色譜峰與其相鄰色譜峰均能達到基線分離，分離度符合要求。

注：A.對照品；B.供試品。圖1 千斤拔及對照品HPLC圖

2.4 線性關系考察

取2.2.1項下的混合對照品溶液梯度溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，分別注入液相色譜儀，按2.1色譜條件測定，記錄色譜峰面積。以各組分質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。染料木苷的回歸方程為Y=53 167X+151 520(r=0.999 7)，染料木素的回歸方程為Y=7259X+48 586(r=0.999 8)，染料木苷在質量濃度17.483～279.720 μg·mL-1與峰面積線性關系良好；染料木素在質量濃度4.088～65.406 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按2.1色譜條件分析，重復進樣6次，記錄色譜峰面積。結果，染料木苷和染料木素峰面積的RSD分別為0.40%和1.09%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取2.2.2項下的供試品溶液，分別在放置0、2、4、8、12、24 h時按2.1色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。結果表明，染料木苷和染料木素峰面積的RSD分別為0.76%和0.58%(n=6)，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取大葉千斤拔樣品(批號：141208)6份，精密稱定，按2.2.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，分別測定6份樣品中染料木苷和染料木素的含量，計算RSD值。結果RSD值分別為1.08%和3.16%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.8 中間精密度試驗

同2.7操作，分別由兩名不同的分析人員使用不同的儀器對本品進行含量測定，計算RSD值。結果表明，染料木苷和染料木素含量測定的RSD值分別為5.78%和3.15%(n=12)，表明本方法中間精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗

取大葉千斤拔粉末(批號：141208)約2.5 g(共9份)，精密稱定，分置具塞錐形瓶中，分別加入對照品溶液量為樣品量對應化合物量的50%～150%，設3次重復，按2.2.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣分析，計算回收率，結果見表3和4。

2.10 樣品含量測定

取9批次千斤拔樣品各5.0 g，精密稱定，分別按2.2.2方法制備供試品溶液，并按2.1色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算樣品中各待測物質的含量，結果見表5。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

文獻報道[13]，染料木苷和染料木素在261 nm波長處有最大吸收，本文對染料木苷和染料木素進行紫外掃描，發現染料木苷和染料木素在260 nm波長處有最大吸收，故最終將其測定波長定為260 nm。

3.2 提取方法選擇

本方法考察不同質量分數乙醇水及不同質量分數甲醇水作為提取溶劑對染料木苷和染料木素提取率的影響，結果隨著有機溶劑比例從30%增加到50%，染料木苷和染料木素的提取率增加，有機溶劑比例從50%增加到95%，染料木苷和染料木素的提取率下降，且50%乙醇水提取出的染料木苷和染料木素的總量最高，故選定50%乙醇水作為提取溶劑。提取時間采用熱回流提取30、60、90 min，發現隨時間的推移含量增加，但是增加不大，故選擇50%乙醇水熱回流提取60 min。

3.3 流動相選擇

本方法在楊啟明等[13]所使用的相關方法上進行優化，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相梯度洗脫，能使待測組分得到很好分離。

3.4 不同產地各成分含量測定結果分析

通過對不同產地蔓性千斤拔和大葉千斤拔的含量測定結果分析，蔓性千斤拔以云南勐侖和湖南炎陵兩個地區產的染料木苷和染料木素的含量最高，大葉千斤拔以福建泉州產的染料木苷和染料木素的含量最高，提示其可能是最適合千斤拔生長的環境，結合其他研究可以進一步確定千斤拔屬植物產地的道地性。

本研究所建立的含量測定方法能夠用于同時測定千斤拔中染料木苷和染料木素的含量，方法操作簡便、精密度高、分離效果好，可為千斤拔藥材的質量評價以及合理開發利用提供依據。