陜產鐵棒錘不同生長期不同器官中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿的含量動態積累規律研究△

楊長花，彭修娟，衛昊，盧憲珍

(1.陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；3.陜西核工業二一五醫院，陜西 咸陽 712000)

鐵棒錘AconitumpendulumBusch來源于毛茛科烏頭屬植物，藥用部位為塊根及幼苗[1]。鐵棒錘塊根能祛風止痛，散瘀止血，消腫拔毒，用于風濕關節痛，腰腿痛，跌打損傷；外用治淋巴結結核(未破)，癰瘡腫毒[2]；幼苗具有解毒，消腫止痛的功效，用于跌打損傷，刀傷，癰腫，瘡癤[1]。主產陜西南部、西藏、云南西北部、四川西部、青海、甘肅南部及河南西部[3]。鐵棒錘含有烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿、3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿等二萜類生物堿[4-7]，二萜類生物堿既是有效成分，也是毒性成分，3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿有顯著的鎮痛抗炎活性[8-9]，筆者已經測定了烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿的含量，現對3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量進行測定。據《陜西中草藥》記載，鐵棒錘以其塊根入藥味苦辛，性熱，有大毒，具活血祛瘀，祛風濕，止痛的功效，用于跌打損傷，風濕性關節炎，腰腿痛，勞傷，惡瘡，癰腫，無名腫毒，凍瘡，毒蛇咬傷等。民間一直以采挖野生資源入藥，隨著資源采挖量的日益增加和環境惡化，野生資源日趨枯碣，藥用部位的綜合利用是解決這一問題的有效途徑。國內對鐵棒錘研究主要集中在塊根的化學成分上，而對地上部分(莖、葉、花、果實)的生物堿研究較少[6]。本研究采用HPLC法測定鐵棒錘不同生長期不同藥用部位中3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量，旨在認識生物堿在植物內積累的動態變化過程，為人工采收、合理使用、資源開發、質量控制、安全用藥等提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(品牌：Waters，型號：E2695，2489紫外檢測器)；TE124S分析天平(萬分之一，Sartorius公司)；CP225D電子分析天平(十萬分之一，Sartorius公司)；PHS-3CPH酸度計(上海佑科)；FW-100D高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限責任公司)。

1.2 實驗試藥

3-乙酰烏頭堿對照品、去氧烏頭堿對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號P09J7F17616、R29S7F22212，HPLC≥98%)，乙腈、碳酸氫銨、鹽酸、甲醇、乙醚、三氯甲烷、硫酸、濃氨水，其中乙腈為色譜純，其余為分析純。

鐵棒錘于2015年6月到9月采自秦嶺太白山上板寺地區，洗凈，經陜西中醫藥大學雷國蓮教授鑒定為鐵棒錘AconitumpendulumBusch，分離根、莖、葉、花、果實等藥用部位，干燥，粉碎備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm，20 μm)；流動相：A(乙腈)，B(0.03 mol·L-1碳酸氫銨溶液，濃氨水調PH值到9.5)，洗脫程序見表1梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm[10]。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿對照品適量，用0.01%鹽酸-甲醇溶液配置成濃度分別為664、735 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取鐵棒錘粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚60 mL和氨試液4 mL，密塞，搖勻，靜置過夜，過濾，藥渣加入乙醚40 mL連續超聲1 h，過濾，然后用乙醚洗滌藥渣3次，每次10 mL，過濾，合并濾液與洗液，低溫蒸干，棄去藥渣。殘渣加三氯甲烷2 mL使溶解，轉入分液漏斗中用三氯甲烷3 mL分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中再用0.05 mol·L-1硫酸提取三次，每次5 mL，用10 mL三氯甲烷洗滌酸液，加氨試液將酸液pH值調至9，然后用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，最后用20 mL水振搖洗滌三氯甲烷液，低溫蒸干三氯甲烷液。殘渣用適量0.01%鹽酸-甲醇溶解轉入5 mL容量瓶中，用0.01%鹽酸-甲醇定容至刻度線，搖勻[10-12]。

2.4 線性關系考察

精密吸取2.2項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μL，進樣，測定峰面積，以對照品進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，做標準曲線。得回歸方程為3-乙酰烏頭堿Y=0.6×106X-1.3×104，r=0.999 8；去氧烏頭堿Y=1.2×106X+3.78×105，r=0.997 4，表明3-乙酰烏頭堿在0.664～6.64 μg范圍內呈良好線性關系，去氧烏頭堿在0.735～7.35 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取2.2項下混合對照品溶液，進樣4 μL，重復進樣5次，記錄峰面積，3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.7%、1.14%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取樣鐵棒錘塊根藥粉1份，按2.3供試品溶液制備方法進行處理，分別在2、4、6、8、10 h進樣20 μL，測定峰面積，3-乙酰烏頭堿，去氧烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.77%，0.54%，表明3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿樣品溶液在10 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取鐵棒錘塊根藥粉5份，按照2.3供試品溶液制備方法進行處理，分別進樣20 μL，測定峰面積，3-乙酰烏頭堿，去氧烏頭堿含量的RSD分別為4.77%、2.37%，表明重現性良好。

2.8 回收率試驗

精密稱取已知含量的鐵棒錘塊根藥粉5份，分別精密加入混合對照品溶液，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定峰面積，計算回收率，3-乙酰烏頭堿平均回收率為90.04%，RSD為10.49%；去氧烏頭堿平均回收率為92.99%，RSD為7.37%。

2.9 樣品測定

取不同生長期不同藥用部位的鐵棒錘粉末，按照2.3項下制備供試品溶液，進樣20 μL，測定峰面積，代入線性方程，計算樣品含量。不同生長期不同藥用部位鐵棒錘中3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿的含量見表2，色譜圖見圖1，點線圖見圖2和圖3。

鐵棒錘整個生長周期中，2種活性成分在各部位累變化的趨勢基本一致，根、莖、葉在苗期(6月)和盛花期(8月)3-乙酰烏頭堿出現2個峰值，在苗期(6月)和7月(花前期)去氧烏頭堿出現2個峰值，苗期、花前期、花期，活性成分含量高，具有資源開發利用價值。果實中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量均較高，具有資源開發利用潛力。

表2 鐵棒錘不同生長期不同器官中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿的含量

注：A.混合對照品色譜圖；B.鐵棒錘苗期幼苗色譜圖；C.鐵棒錘花前期塊根色譜圖；D.鐵棒錘花前期葉色譜圖；E.鐵棒錘花前期莖色譜圖；F.鐵棒錘盛花期塊根色譜圖；G鐵棒錘盛花期葉色譜圖；H.鐵棒錘盛花期莖色譜圖；I.鐵棒錘果期塊根色譜圖；J.鐵棒錘果期葉色譜圖；K.鐵棒錘果期莖色譜圖；L鐵棒錘果期果實色譜圖；1.去氧烏頭堿；2.3-乙酰烏頭堿。圖1 鐵棒錘不同生長期不同器官色譜圖

圖2 6～9月鐵棒錘各部位中3-乙酰烏頭堿的累積變化

圖3 6～9月鐵棒錘各部位中去氧烏頭堿的累積變化

3 討論

鐵棒錘幼苗3-乙酰烏頭堿的含量是0.015 1%，去氧烏頭堿的含量是0.166 7%，含量均高于不同生長期根中的含量，幼苗中3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量均較高，鐵棒錘幼苗是藏醫使用的藥用部位之一，說明是合理的。花前期、花期3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿含量較高，綜合比較，鐵棒錘采收的最佳時節應該是花期。3-乙酰烏頭堿的含量，花前期含量葉>莖>根，盛花期含量葉>莖>根，果期含量葉>果實>根>莖，葉、莖及果實中3-乙酰烏頭堿的含量高于不同生長期根中的含量，具有資源的開發利用潛力。在整個生長期鐵棒錘葉是3-乙酰烏頭堿含量最高的器官，在盛花期達到最大值，3-乙酰烏頭堿是次生代謝產物，盛花期植物綠色部分光合作用強，初生和次生代謝旺盛，可能產生并積累了較多的3-乙酰烏頭堿，使葉和莖中3-乙酰烏頭堿的含量較高。盛花期后進入果期，生長緩慢，同時繁殖器官的營養消耗增大，可能活性成分也進行了轉移，導致了葉、莖中3-乙酰烏頭堿含量的降低和果期果實及根中3-乙酰烏頭堿含量的增加。果期葉中3-乙酰烏頭堿的含量仍高于其他器官，說明鐵棒錘葉資源具有巨大的開發利用潛力。鐵棒錘根、莖、葉中3-乙酰烏頭堿的積累趨勢不同，更加證實了這個結論鐵棒錘莖、葉中的3-乙酰烏頭堿大量轉移到根及果實中，使根及果實中3-乙酰烏頭堿含量增加，葉及莖中3-乙酰烏頭堿含量的大幅度下降。去氧烏頭堿的含量，花前期含量葉>根>莖，盛花期含量葉>根>莖，果期含量果實>根>葉>莖，葉中去氧烏頭堿的含量高，具有資源的開發利用潛力。葉中去氧烏頭堿的含量花前期和盛花期高于根，在花前期達到最大值。去氧烏頭堿是次生代謝產物，花前期葉片光合能力強，初生和次生代謝旺盛，可能產生并積累了較多的去氧烏頭堿，使葉中去氧烏頭堿的含量達到最大值。進入盛花期，生長緩慢，可能活性成分也進行了轉移，導致了莖、葉中去氧烏頭堿含量的降低；鐵棒錘根、莖、葉中去氧烏頭堿的積累的變化趨勢相同，植物在盛花期和果期的繁殖器官進行了組織結構的快速生長和營養物質的大量積累，可能其積累的量遠大于積累的去氧烏頭堿的量，導致根中去氧烏頭堿的含量不是升高而是降低，計算根整個器官中去氧烏頭堿的總量發現去氧烏頭堿的總量是增加的，更說明去氧烏頭堿是轉移到了根中。近年來，鐵棒錘資源需求量與日俱增，供不應求，鐵棒錘葉、莖、果實作為一種富含3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿的器官，具有資源開發利用潛力，本研究探討了3-乙酰烏頭堿及去氧烏頭堿在植物體內積累的動態變化過程，為應用提供科學依據。