山牽牛炭疽病病原分離與鑒定△

宋利沙，蔣妮*

(1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023)

山牽牛Thunbergiagrandiflora(Rottl.ex Willd.)Roxb.，別名大花山牽牛、大花老鴨嘴、大青和老鴨杓，是爵床科Acnthaceae山牽牛屬藤本植物[1]。山牽牛在廣西、廣東、海南和福建鼓浪嶼均有種植。山牽牛是瑤醫藥用植物之一，主要用于消腫拔毒，排膿生肌，止痛。根皮用于跌打損傷和骨折。莖葉蛇咬傷，瘡癤，葉用于治療胃痛[2-3]。目前，對山牽牛主要做為觀賞藤本植物[4]，對其藥理活性和病害研究尚未見報道。作者在廣西藥用2017年在廣西南寧市廣西藥用植物園瑤藥區調查發現一種嚴重影響山牽牛生長的病害，該病害主要為害山牽牛葉片，嚴重時造成葉片枯死。鏡檢發病組織上的病原孢子，初步將病原菌判斷為炭疽菌屬Colletotrichumsp.真菌，為進一步明確該病原菌的分類地位，本研究對病原菌進行了分離，并通過形態學和分子生物學相結合的方法進行鑒定，為該病害的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山牽牛病株于2017年3月采自廣西壯族自治區南寧市興寧區廣西藥用植物園瑤藥區。

1.2 病原菌分離和純化

選取山牽牛葉片的病健交界處病組織，切成 5 mm×5 mm小塊，用75%乙醇浸泡30S，0.1%升汞消毒l min，再用無菌水漂洗 3次，置于PDA培養基上 28 ℃培養，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進行純化，純化后的菌落通過單孢分離獲得純培養分離物[5]。

1.3 病原菌的致病性測定

用針刺法將分離和純化的菌絲塊(1 cm×1 cm)接種于無病健康且長勢相近的山牽牛葉部[5]，以接種無菌PDA培養基(1 cm×1 cm)作為對照，每個處理3個重復，放置于具有濕潤的濾紙片的培養皿中，保濕培養，定期觀察發病情況。適時對發病組織進行病原菌分離和純化，觀察該病原菌是否與接種菌株相同。

1.4 病原菌形態鑒定

觀察病原菌在PDA培養基上的菌落特征，用光學顯微鏡觀察菌絲、分生孢子等形態特征，對病原菌進行形態鑒定。

1.5 分子生物學鑒定

將純化好的拮抗菌株移植于PDA平板培養基上，培養3 d，然后接種到40 mL PDA培養液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒溫振蕩培養48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因組DNA。ITS擴增引物序列為通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′)。擴增反應在25 μL反應體系中進行，Template(基因組DNA 20～50 ng·μL-1)為0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)為2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)為1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。熱循環反應程序設置如下：94 ℃下初始變性4 min，接下來為94 ℃下變性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸 60 sec，30個循環結束后在72 ℃下修復延伸10 min。擴增中利用水代替DNA模板為空白對照。用凝膠電泳法檢測PCR反應結果，吸取4 μL PCR產物加入1%(W/V)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液(0.9 M Tris-Borate，0.01 M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下電泳40 min。將擴增后的 DNA 產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序。并且把測序結果與GenBank中的序列進行blast比對。以ITS相似序列，利用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果分析

2.1 病害癥狀

該病主要危害山牽牛葉片。葉片發病后，病斑在葉尖、葉緣、葉中部近圓形或不規則形狀發展。病斑發病初期，出現黑色小斑點，隨后擴大成多邊形黑褐色病斑，病斑周圍有黃色暈圈，后期病斑穿孔，病斑較多時融合成片，病葉后期葉片黃化枯死(圖1)。該病害在山牽牛生長期均可發生，且種種植密度大、排水不良的地塊發病較重；高溫氣候，多雨季節，發生嚴重，蔓延迅速。

圖1 山牽牛葉部危害癥狀

2.2 病原菌分離和致病性測定

對山牽牛葉片病斑進行病原分離，分離純化得到形態特征不同的真菌菌株4株。用針刺法將這些菌株接種在離體健康山牽牛葉片上，只有sb10菌落致病。接種后5 d葉片開始發病，7 d后接種部位變黑褐色病斑，病斑周圍暗黃褐色。對照葉片組織未發病。從發病的病斑上再次分離到與接種菌株形態一致的病原菌。

圖2 山牽牛炭疽病離體接種癥狀

2.3 病原菌的形態鑒定

病原菌sb10在PDA平板上，28 ℃培養5～7 d，菌落圓形，邊緣整齊，菌落從中央變為深灰黑色，菌落背面是深灰色同心輪紋，培養6 d后，菌落中央產生紅色球形的分生孢子團。該病菌的菌絲有隔，粗度為2～4 μm，分生孢子盤圓形或橢圓形，黑褐色，直徑112～248 μm；剛毛散生于分生孢子盤上，深褐色；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大小(11～21)μm×(4～6)μm。

參照《真菌鑒定手冊》[7]和《植物病原真菌學》[8]，將該病原菌鑒定為半知菌類腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

注：a.菌落；b.分生孢子盤；c.分生孢子。圖3 山牽牛炭疽病病原形態

2.4 病原菌的分子(ITS)鑒定

利用真菌 ITS 通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原真菌的 rDNA內轉錄區進行擴增，獲得片段大小約為 563 bp 的擴增產物。將擴增后得到的產物在 GenBank 中進行 BLAST比對，結果顯示，與山牽牛病病原菌的 ITS 序列相似度在 99% 以上的菌株為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，并與其相似高的菌株構建系統發育樹(圖4)，綜合菌株sb10形態學和分子生物學鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

圖4 基于ITS序列構建sb10菌株系統發育樹。

3 結論和討論

山牽?？勺髦兴幉氖褂?，也可作為觀賞的藤本植物，其栽培和開發利用有很大的廣闊前景。作者在廣西藥用植物園種植區發現較嚴重的炭疽病，并利用形態學和分子手段將該病原鑒定為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。該炭疽菌可危害地榆、田七、貓豆、闊葉十大功勞等多種植物[9-12]，是世界上分布最廣的病原菌，但此病原危害山牽牛的葉片為國內第一次報道。此外，膠孢炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質性等方面可形成許多亞組和形態種[9]。本研究所獲得菌株的寄主范圍和?；痛_定有待進一步研究確定。該病原菌的生物特性、侵染循環、發病條件、防治技術、藥理活性等需要進一步研究加以明確。

目前，山牽牛炭疽病可參考由膠孢炭疽菌引起的其他作物炭疽病的防治技術進行控制，如選用無病種子或進行種子消毒、及時清除病殘體、合理密植、創造良好的通風透光條件、合理施肥用水等，或在發病初期使用25%咪鮮胺乳1500倍液噴霧。具體藥劑種類及綜合防治技術尚待室內篩選試驗和田間實踐驗證。