薄層掃描法同時測定三七細粉中皂苷含量△

何福龍，鄭艷萍，任娟，金俊杰2，，白發平，蔡寶昌2，

(1.廣西賀州職業學院，桂東衛生學校，廣西 賀州 542899；2.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061)

三七為五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的塊根[1]。三七現代藥理作用主要體現在對心血管和腦血管等血液系統、神經系統、代謝和免疫調節系統等的影響[2-3]。三七自古以活血散瘀功效著名，能抗血小板聚集，抗血栓形成[4]。其主要有效成分為皂苷類化合物[1]，迄今已從三七中分離得到70余種三萜皂苷，其中以三七皂苷R1，人參皂苷Rb1、Rg1和Rd 等皂苷類成分含量較高。三七皂苷類成份的定量分析可采用 TLC、HPLC、GC和比色法等方法。比色法基于三萜骨架結構或糖基和羧基的化學反應，專屬性差且只能測定總皂苷的含量[5]；氣相色譜雖然具有較高的靈敏度和分辨率，但樣品需要復雜的前處理以降低其沸點[6]；高效液相色譜法是目前廣泛使用的方法，利用梯度洗脫，可使大部分皂苷較好的分離，但是由于三萜皂苷分子中不具備較好的發色團[7]，UV檢測常用波長為203 nm，許多化合物及溶劑都對檢測有干擾。TLCS可以同時進行多通道的展開、掃描，節約使用溶劑和時間，是皂苷類成分分析的常用方法之一。

本研究通過薄層掃描法同時測定三七細粉中人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量，建立同時測定三種皂苷的含量的薄層掃描的方法。本實驗采用薄層色譜掃描法，通過對供試品溶液的制備、展開條件的改進，使人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的色譜斑點分離良好，掃描色譜峰穩定、可測，并在不同批次的三七粉中得到了驗證，取得了較好的分離效果，可以同時測定多個樣品中三個皂苷的含量，大大提高了該品種的檢測效率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CAMAG公司薄層色譜系統，包括半自動點樣儀linomat5-1507及自動成象系統Visnaliter-151204；FA1104型電子分析天平，精度0.01 mg(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

三七細粉：南京海源中藥飲片有限公司，批號：151023、160307、160601，規格：66 g/瓶，亳州中藥材市場購買兩批(S1、S2)，云南文山購買一批(Y1)；人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-201530)、三七皂苷R1對照品(批號：110745-201619)、人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-201424)，均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G(青島海洋化工廠分廠)；其余試劑均為分析純；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對照品適量，分別精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.504、0.501 、0.492 mg·mL-1混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取本品三七細粉0.2 g，置索式提取器中，加乙醚80 mL，加熱回流提取1 h，棄去乙醚液，藥渣揮去溶劑，加甲醇80 mL， 加熱回流至無色，提取液揮干，殘渣加甲醇適量，并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液，備用[8-9]。

2.3 預處理、層析及測定

照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版通則0502)試驗，精密吸取混合對照品溶液2、8 μL，供試品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，晾干，至366 nm下檢視后(見圖1)，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠帶固定，照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版通則0502)進行掃描(見圖2)，檢測波長510 nm，參比波長700 nm，測得供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，根據外標兩點法計算，即得。

注：1.混合對照品2 μL(從下到上分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1)；2.混合對照品 8 μL(從下到上分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1)；3～4.供試品Y1；5～6.供試品S1；7～8.供試品S2；9～10.供試品151023；11～12.供試品160307；13～14.供試品160601。圖1 三七薄層色譜圖(366 nm)

注：1.混合對照品2 μL(從左到右分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1)；2.混合對照品 8 μL(從左到右分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1)；3～4.供試品Y1；5～6.供試品S1；7～8.供試品S2；9～10.供試品151023；11～12.供試品160307；13～14.供試品160601。圖2 三七薄層掃描3D色譜圖(檢測波長510 nm，參比波長700 nm)

2.4 線性關系的考察

精密吸取上述混合對照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL，分別點于薄層板上，按上述2.3項方法測定(見圖3，圖4)吸光度積分值，以人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1進樣量為自變量 (X)，峰面積積分值為因變量 (Y)，進行線性回歸，得回歸方程Y人參皂苷Rb1=1 120.1X+271.29，r=0.998 5；Y三七皂苷R1=2 105.2X+135.20，r=0.999 1；Y人參皂苷Rg1=1 085.1X+71.034，r=0.998 2。實驗表明，人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1在0.504～5.04 、0.501～0.504、0.492～4.92 μg范圍內具良好的線性關系。

注：從下到上分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1對照品。圖3 混合對照品薄層色譜圖(366 nm)

注：1～6分別為混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL點樣的薄層掃描圖(從左到右分別是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1掃描峰)。圖4 混合對照品薄層掃描3D色譜圖(檢測波長510 nm，參比波長700 nm)

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液2 μL，分別點于2塊薄層板上，各點6份，按2.3項下方法進行測定，結果人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的 RSD 分別為1.87%、1.02%、1.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液(批號：160601)2 μL按上述方法于0、10、20、40、60 min測定，結果，人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1峰面積RSD分別為 1.64%、1.96%、 1.72%。結果表明樣品60 min內測定穩定。但文獻[9]認為顯色后30 min測定較好。

2.7 重復性試驗

取三七粉(批號：160601)樣品5份，按2.2、2.3的方法進行提取、展開、顯色、測定。測得該批號三七細粉中人參皂Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1質量分數平均值為31.25、50.72 、59.86 mg·g-1，RSD分別為1.53%、1.05%、1.86%，結果表明此方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

精密稱定三七粉(批號：160601，含人參皂苷Rb131.25 mg·g-1、三七皂苷R150.72 mg·g-1、人參皂苷Rg159.86 mg·g-1)樣品0.1 g，精密加入人參皂苷Rb1對照品約3 mg、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對照品約6 mg，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按上述方法測定，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收實驗結果(n=6)

2.9 樣品測定

取三七粉6批，按照2.2項下方法制備供試品溶液，同法測定，結果見表2。

3 討論與小結

《中華人民共和國藥典》2015年版一部三七項下鑒別方法處理三七樣品，展開后薄層斑點較多，分離度不好，薄層掃描色譜峰相互交叉，定量不精確。本實驗測定方法在此基礎上進行了修改，采取先用乙醚提取，除去部分極性較低的成份后，加甲醇回流提取人參皂苷類成分進行薄層色譜分析，薄層色譜斑點少，分離度良好，定量精準[10]。

樣品預提取、展開晾干后，噴10%硫酸乙醇溶液110 ℃烘至顯色清晰后，應立即用等大的透明玻璃板覆蓋，周圍并用透明膠封嚴，以免斑點氧化褪色。人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的定量測定方法也有采用 HPLC 法[11]，但因其為末端吸收低，測定時間長、成本高、速度慢等問題不適合三七檢測，而TLCS法解決了過這些問題，可以在同一塊薄層板上同時測定多個樣品，且速度快，同時避免了末端吸收差的問題。因此本研究所建立的方法更易于廣泛推廣和三七的快速檢測。