不同商品規格決明子的質量分析△

楊國靜，張珞琪，陳隨清，王利麗

(河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046)

決明子為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子。具有清肝明目、潤腸通便的作用[1]。研究表明決明子中的含有蒽醌類、萘并吡喃酮苷類脂肪酸類以及無機元素等，主要有效成分為蒽醌類[2-3]，且有研究表明萘并吡喃酮苷類的含量也不低。現代藥理研究表明決明子具有降脂、降壓、抗誘變以及保肝的作用[4-5]。近年來對決明子的質量研究日益增多，如紀亞明[6]在不同產地決明子的有效成分含量差異與品質評價中得出河南、安徽、四川區域決明子蒽醌含量較高；張毅等[7]在HPLC測定不同產地決明子中蒽醌類成分得出不同產地間的7個蒽醌類成分差異較大。基本集中在產地之間的對比，對決明規格之間的對比卻很少，并且近些年來大量進口決明子從緬甸、越南、老撾等國流入國內市場，憑借低廉價格已占領國內市場半壁江山[8]，沖擊國產決明市場，造成市場品種混亂，質量參差不齊。另一方面，決明的栽培技術粗放、良種選育滯后、缺乏資源保護措施等問題制約決明子相關產業的發展[9]。

本實驗通過采集12份不同規格的進口以及國產決明樣品，運用薄層色譜法以及高效液相色譜法對決明子進行質量分析及差別比較，為確保市場規范化以及用藥質量提供依據。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗樣品

4種不同規格決明樣品主要收集于不同藥材市場，經我校陳隨清教授鑒定為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子。詳情見表5。

1.2 實驗儀器與試劑

BSA124S-CW十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、BSA124S萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、Waters 2695高效液相色譜儀、Milli-Q型自動雙重純水蒸餾器(鄭州中譜儀器設備有限公司)。

對照品：橙黃決明素(中國食品藥品檢定研究院，111900-201504)、決明子苷(成都昂賽思生物科技有限公司)、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、紅鐮霉素龍膽二糖苷(上海源葉生物科技有限公司，批號分別是T26O7F23603、P19A7F13264、P26M7F15364、T10M8Z31177)。乙腈、四氫呋喃為色譜純，其他為分析純，水為雙蒸水。

2 實驗方法與結果

2.1 性狀鑒別

國產決明與進口決明無明顯差別，均為表面綠棕色或暗棕色，形狀為不規則的圓柱形，兩端一端平坦，另一端為為稍傾斜。大多決明子表面以及背面各有一條棱線，少數棱線不明顯，在棱線兩側有兩條的凹陷狀，凹陷平行對稱。質地堅硬，不易破碎。

國產小決明與進口小決明也無明顯差別，均為圓柱形，較小，表面綠棕色或暗棕色，表面棱線兩側各有1片寬廣的淺黃棕色帶。質堅硬，不易破碎。

2.2 顯微鑒別

注：A.決明；B.小決明；1.草酸鈣簇晶；2.柵狀細胞；3.支柱細胞圖1 決明子粉末顯微圖

A為決明粉末，草酸鈣簇晶較少且小，直徑3～13 μm。柵狀細胞側壁不均勻加厚，直徑40～65 μm。支柱細胞側面觀呈啞鈴型，表面觀可見兩層同心圓。

B為小決明粉末，草酸鈣簇晶較多且大，直徑6～19 μm。柵狀細胞側壁不均勻加厚，直徑38～57 μm。支柱細胞側面觀呈啞鈴型或葫蘆型，表面觀有時可見兩層同心圓。

2.3 薄層鑒別

取12份樣品粉末各1 g，加甲醇10 mL，浸提1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴鍋上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取橙黃決明素、大黃酚對照品，加無水乙醇：乙酸乙酯(2∶1)制成每1 mL各含1 mg的混合對照溶液。分別吸取上述溶液各2 μL，點于同一硅膠H薄層板上，以石油醚(30℃～60℃)-丙酮(1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后觀察。

注：a為混合標品；1、6、11號為小決明(進口)；3、4、7號為小決明；8、9、10號為決明；2、5、12號為決明(進口)圖2 決明子薄層色譜圖

2.4 大黃酚、橙黃決明素含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；檢測波長284 nm；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL。流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，0～20 min，40%乙腈；20～40 min，40%～60%乙腈；40～50 min，60%～90%乙腈。見圖3。

注：A.混合對照品；B.決明子樣品；1.橙黃決明素；2.大黃酚圖3 決明子樣品與對照品的液相色譜圖

2.4.2 供試品溶液的制備 取各個樣品粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，蒸干，加稀鹽酸30 mL，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30 mL。合并三氯甲烷，回收溶劑至干，用乙酸乙酯-無水乙醇(1：2)溶解轉移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，既得。

2.4.3 混合對照品的制備 取大黃酚與橙黃決明素對照品適量，精密稱定，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)制成質量濃度分別為0.033、0.022 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取上述2.4.2項下混合對照品2、4、8、10、16 μL，按2.4.1項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得橙黃決明素回歸方程為Y=8 272.2X-177.21(r=0.999 6)，線性范圍是0.04～0.35 μg，得大黃酚回歸方程為Y=1 991.4X+2.42(r=0.999 9)，線性范圍是0.07～0.53 μg。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.4.1項下色譜條件重復進樣6次，計算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為0.96%，0.84%，表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 精密稱取同一供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h按2.4.1.1 項下色譜條件進樣10 μL，計算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.85%，1.14%，表示供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按2.4.2項下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.1項下色譜條件測定，計算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.66%，1.17%，表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密稱定同一批號已知含量的粉末約0.25 g，6份，置錐形瓶中，于每份樣品中精密加入適量橙黃決明素、大黃酚對照品，按2.4.2項下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.1項下色譜條件測定，計算橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為97.10%，98.22%，RSD值分別是1.12%，1.48%，結果見表1，表2。

2.4.9 含量測定 分別精密吸取上述對照品溶液與12份供試品溶液10 μL，按2.4.1項下色譜條件測定，結果見表5。

2.5 紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Waters symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-四氫呋喃-1%冰醋酸(17∶2∶81)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長278 nm。

注：A.混合對照品；B.決明子樣品；1.紅鐮霉素龍膽二糖苷；2.決明子苷圖4 決明子樣品與對照品的液相色譜圖

2.5.2 對照品溶液的制備 分別稱取紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷適量，精密稱定，加甲醇溶解，配置成濃度分別為0.27、0.23 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取各個樣品粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取25 mL，蒸干，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，備用。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取上述2.5.2項下混合對照品2、4、6、8、10 μL，按2.4.2.1項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得紅鐮霉素龍膽二糖苷回歸方程為Y=3 387 151X-301 731(r=0.999 8)，線性范圍是0.5～5.45 μg，決明子苷回歸方程為Y=2 354 587X-241 825(r=0.999 5)，線性范圍是0.46～4.6 μg。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.5.1項下色譜條件重復進樣6次，計算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為0.74%，0.57%，表明儀器的精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗 精密稱取同一供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h按2.5.1項下色譜條件進樣10 μL，計算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為1.12%，表示供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按2.4.2.3項下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.2.1項下色譜條件測定，計算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為1.76%，表明該方法重復性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱定同一批號已知含量的粉末約0.25 g，6份，置錐形瓶中，于每份樣品中精密加入適量紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷對照品，按2.5.3項下方法制備，分別吸取10 μL，按2.5.1項下色譜條件測定，計算橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為99.29%、99.21%，RSD值分別是2.51%、1.81%，結果見表3，表4。

2.5.9 含量測定 分別精密吸取上述對照品溶液與12份供試品溶液10 μL，按2.5.1項下色譜條件測定，計算其各個成分含量。對含量測定結果進行方差分析以及用字母進行顯著性標記。字母標記法是含有相同字母之間無差異，含不同字母之間具有顯著性，小寫字母表示顯著性，大寫字母表示極顯著性差異。結果見表5、表6。

表5 決明有效成分含量測定結果 mg·g-1

表5續

表6 決明子有效成分含量測定分析結果

注：小字母表示具有顯著性差異(P<0.05)；大寫字母表示具有極顯著性差異(P<0.01)。

3 結果與討論

通過顯微(圖1)可以看出決明與小決明中都含有草酸鈣簇晶、柵狀細胞以及支柱細胞。其中決明中的草酸鈣簇晶較小決明的小，柵狀細胞的直徑較小決明大。而小決明的支柱細胞側面觀較決明多了啞鈴型。從顯微可以看出決明與小決明有一定區別。

薄層色譜圖(圖2)中亮黃色斑點為橙黃決明素，粉紅色斑點為大黃酚。不同規格決明子中都含有橙黃決明素和大黃酚，并且可以看出4、8、12號在橙黃決明素標準品相應的位置上斑點較明顯，可能其含量較高，而1、2、5、6、11號相應位置斑點不明顯，可能其含量較低。但大黃酚相應位置斑點明顯程度相差不大。含量測定將進一步確定其高低。

從方差分析(表6)結果可以看出在4個不同規格決明子之間，橙黃決明素與大黃酚兩個成分之間無明顯差別，紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷兩個成分之間有顯著差別，從表5中的平均值看，決明的橙黃決明素、大黃酚、紅鐮霉素龍膽二糖苷以及決明子苷的含量要高于其它規格決明子且符合藥典標準。其次為小決明、決明(進口)，小決明(進口)含量最低。然而小決明(進口)的決明子苷要高于小決明。由于決明子苷不是決明子的指標性成分，需進一步研究。

從表6中的平均值看，決明的橙黃決明素和大黃酚的含量要高于小決明且符合藥典標準，可能與種植環境有關。決明喜溫暖濕潤氣候，陽光充足有利于其生長，不耐旱，土壤以排水良好、肥沃疏松為佳，陰坡地、低洼地生長不良[10]。現今決明人工種植廣泛，而小決明野生居多，野生環境可能造成其生長不良，導致其含量較低。從表1中可以得出大部分進口決明的橙黃決明素和大黃酚2個有效成分的含量均低于藥典標準，可能是由于進口決明在國外一年種兩季，生長期較短導致含量降低[7]。不能代替國產決明作為藥用。這與閆婕等[11]HPLC測定全國不同產地及進口決明子大黃酚與橙黃決明素含量的結果相類似，發現國產決明的質量優于進口決明。這為決明子的開發利用以及綜合質量評價提供依據。