基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究杜仲抗骨質(zhì)疏松的分子機制△

李嘉程，許波，李剛*，閻博昭，夏聰敏，梁學(xué)振，駱帝

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院 顯微骨科，山東 濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355)

隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率也逐年上升，現(xiàn)已成為世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。骨質(zhì)疏松癥是骨量減少、骨內(nèi)微細結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致的骨脆性增加、骨折風(fēng)險增大的系統(tǒng)性骨代謝疾病，是老年人的常見病、多發(fā)病[2-3]。目前，治療OP的公認藥物主要包括骨吸收抑制劑、骨形成促進劑、骨礦化物三大類。但從藥物相關(guān)的治療效果來看，如今僅僅局限于改善臨床癥狀、延緩病情進展，且上述藥物的靶向性均較單一，因此亟需尋找新的思路解決這一問題[4]。而中藥及其復(fù)方治療OP以溫補腎陽、強筋壯骨、填精生髓為主，兼以益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)散寒除濕、通絡(luò)止痛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[5]，中藥及其復(fù)方在系統(tǒng)防治OP方面具有獨特優(yōu)勢和廣闊發(fā)展前景。

杜仲具有補肝腎、強筋骨的功能，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力[6]。但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制至今尚不明確。因此，分析杜仲的有效活性成分和作用靶點，分析其可能的作用機制，有利于闡述杜仲的科學(xué)內(nèi)涵，并促進其臨床推廣應(yīng)用。目前，現(xiàn)有的研究中藥及其復(fù)方的手段往往存在各種問題，以至于難以闡釋其作用機制。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測杜仲可能入血的有效活性成分，配合化合物相似性分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的手段，預(yù)測杜仲治療OP的作用靶點，探討其可能的作用機制。流程圖見圖1。

圖1 杜仲治療骨質(zhì)疏松癥的分子機制分析流程圖

1 方法

1.1 杜仲中活性成分的篩選和靶點預(yù)測

本研究通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺[7](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，對杜仲所有成分數(shù)據(jù)庫進行了篩選及構(gòu)建，其中篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18[8]；采用TCMSP靶點預(yù)測模型對相關(guān)活性成分作用靶點加以預(yù)測。

1.2 杜仲“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建

杜仲“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”主要通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape3.2.1[9]進行構(gòu)建和分析，本研究將從上述獲得的活性成分及靶點關(guān)系進行導(dǎo)入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中用“節(jié)點”(node)表示分子、靶蛋白，用“邊”(edge)表示成分與靶點之間的關(guān)系；采用network analyzer插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確杜仲中較為重要的成分和靶點，結(jié)合文獻以分析其中的相互作用。

1.3 已知的OP相關(guān)疾病靶點檢索

利用“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，對五大常用數(shù)據(jù)庫(TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD、PharmGKB等)進行已知疾病靶點的檢索及篩選，并刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點。

1.4 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制主要借助于BisoGenet插件，將杜仲上述的作用靶點和OP相關(guān)的疾病靶點分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，利用Biso Genet插件對2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制，同時利用cytoscape合并2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，抽取獲得的交集網(wǎng)絡(luò)。

基于交集網(wǎng)絡(luò)，采用網(wǎng)絡(luò)拓撲分析插件Cyto NCA[10]篩選出自由度大于所有節(jié)點自由度中位數(shù)2倍的節(jié)點，即“Big hubs”；篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，再篩選其他幾個指標大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點，即關(guān)鍵基因。上述獲得的相關(guān)活血成分及靶點則有可能是杜仲發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松直接或間接作用的環(huán)節(jié)。

1.5 Pathway富集分析

本研究采用了ClueGO分析插件[11]，對關(guān)鍵靶點進行富集分析，并根據(jù)重要程度繪制信號通路占比餅狀圖；其中ClueGO插件在一定程度上可將富集分析的結(jié)果以節(jié)點的形式展現(xiàn)，以充分發(fā)揮形象的圖像化功能，同一類型的信號通路采用同一種顏色的節(jié)點代表，同時節(jié)點的大小代表了該信號通路的顯著性，信號通路的顯著性越高，節(jié)點越大，說明該通路的重要性越高。

2 結(jié)果

2.1 杜仲活性成分篩選與ADME分析

本研究通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫杜仲中所有的已報道的成分及其成分藥物動力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)參數(shù)的相關(guān)檢索，共搜集到成分94個。根據(jù)OB和DL參數(shù)對杜仲中入血的活性成分進行篩選，共搜集到入血活性成分25個，見表1、圖2。利用相關(guān)靶點預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進行作用靶點預(yù)測，排除重復(fù)靶點，共獲得預(yù)測靶點101個。

圖2 根據(jù)ADME參數(shù)篩選出的杜仲入血活性成分分布圖

2.2 杜仲“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建和分析

將上述活性成分及預(yù)測靶點采用Cytoscape 對潛在活性成分和作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制和分析，并以關(guān)鍵節(jié)點確定杜仲中發(fā)揮重要作用的成分和靶點，根據(jù)不同靶點與成分對應(yīng)關(guān)系數(shù)目，分別進行分類展示。靶點對應(yīng)成分越多，說明該靶點相對重要性越高。如圖3所示，通過Cytoscape網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共獲得123個節(jié)點和270個關(guān)系。

注：圖中藍色代表靶點基因名；紅色代表杜仲25個成分中最終入血的白樺脂酸、槲皮素等7個化學(xué)成分。圖3 杜仲活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 OP相關(guān)基因分析和檢索

本研究檢索了5個國際公認的疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，搜集前期研究和報道的與OP發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的已知靶點基因，去重后共檢索到356個已知的靶點。

2.4 杜仲治療OP的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

2.4.1 杜仲治療OP的蛋白相互作用 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機體的內(nèi)在調(diào)控往往不是單一的信號通路支配的，而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)為尋找靶點的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，本研究發(fā)現(xiàn)杜仲可以與6093個靶點產(chǎn)生直接或間接作用，而這些靶點與靶點之間的相互聯(lián)系多達148 246種。與此同時，對OP相關(guān)的靶點繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，也發(fā)現(xiàn)與OP直接或者間接相關(guān)的靶點也多達4921個。本研究利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進一步深入分析杜仲影響OP發(fā)生、發(fā)展中的靶點，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點網(wǎng)絡(luò)，為網(wǎng)絡(luò)分析和機制的探討提供了可能。交集網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。

圖4 杜仲-OP交集網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 杜仲治療OP的關(guān)鍵靶點 本研究通過對杜仲調(diào)控OP的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲屬性分析進行節(jié)點篩選，旨在尋找網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點，在網(wǎng)絡(luò)中獲得更多節(jié)點的傳遞信息和更高的節(jié)點信息傳遞效率，充分發(fā)揮其在網(wǎng)絡(luò)中的重要作用。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，本研究共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點232個。篩選策略示意圖見圖5。

2.5 杜仲治療OP可能的機制分析

本研究對上述232個關(guān)鍵節(jié)點利用ClueGO進行分析，分析其參與的主要信號通路，旨在研究杜仲治療OP可能的作用機制。分析結(jié)果顯示，杜仲除與直接作用于OP關(guān)鍵節(jié)點涉及的信號通路，如Wnt信號通路、NF-kappa B信號通路、FoxO信號通路等有關(guān)，還對P13K-Akt信號通路、GnRH信號通路、甲狀腺素信號通路、雌激素信號通路等同時進行調(diào)控(見圖6)。

3 討論

隨著全球人口數(shù)量增加，伴隨人口老齡化的加速發(fā)展，OP患者人數(shù)逐年遞增，長時間應(yīng)用抗骨質(zhì)疏松藥物尤其是雙膦酸鹽的不良反應(yīng)逐漸被重視[12]，抗骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)仍在不斷探索[13]。許多中藥及復(fù)方在防治OP方面發(fā)揮著重要的作用。中醫(yī)認為，腎乃先天之本，而骨的生長、發(fā)育及衰弱均與腎精盛衰關(guān)系緊密，OP屬腎虛，因此中醫(yī)治療以補腎為主。

注：度中心性(Degree centrality，DC)、介度中心性(Betweenness centrality，BC)、接近中心性(Closeness centrality，CC)、特征向量中心性(Eigenvector centrality，EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(Network centrality，NC)和局部邊連通性(Local average connec-tivity，LAC)。圖5 杜仲關(guān)鍵節(jié)點的目標篩選策略圖

注：A.富集分析餅狀圖；B.ClueGO信號通路顯著富集網(wǎng)絡(luò)圖。圖6 杜仲治療骨質(zhì)疏松癥信號通路富集分析圖

《神農(nóng)本草經(jīng)》將杜仲列為上品，在抗骨質(zhì)疏松方面具有較好的臨床療效[14-16]。本研究根據(jù)OB和DL參數(shù)，共篩選出杜仲中入血的活性成分25個，對上述活性成分進行潛在活性成分和作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制，共獲得123個可能的靶點和270個相互關(guān)系。基于上述結(jié)果可知，杜仲的有效成分之間存在協(xié)同，而協(xié)同調(diào)控的靶點也在OP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮不同作用，具有治療OP的潛力。

從富集結(jié)果分析可知，杜仲主要從直接影響骨代謝和間接調(diào)節(jié)骨代謝兩方面發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。1)直接影響骨代謝。骨吸收和骨形成過程中的動態(tài)平衡異常是導(dǎo)致OP發(fā)生、發(fā)展過程中重要的發(fā)病機制，而影響骨代謝的相關(guān)信號通路也是調(diào)控過程中主要的信號通路。上述結(jié)果顯示，主要富集在雌激素信號通路、Wnt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等。研究表明，雌激素可以通過雌激素受體α或者激活Wnt/β-Catenin信號通路改善人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的能力[17-19]；Wnt信號通路具有調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞分化的雙重作用[20]。Notch在成骨細胞分化過程的早期階段表達時，通過誘導(dǎo)成骨細胞中骨保護素的表達，抑制成骨細胞向成熟成骨細胞表型和成骨細胞功能發(fā)展，從而抑制破骨細胞形成和骨吸收[21]。低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)信號通路對骨形成和骨吸收都有重要作用，該信號通路上調(diào)一方面可通過成血管成骨偶聯(lián)促進骨形成和血管形成[22]；而另一方面又可增加破骨細胞的數(shù)量及破骨活性[23]。MAPK對細胞的增殖、分化進行調(diào)控，在維持骨代謝平衡方面具有重要作用[24]。上述結(jié)果提示，杜仲抗OP的重要機制是調(diào)節(jié)OP發(fā)生、發(fā)展過程中骨代謝平衡異常的相關(guān)信號通路。2)間接影響骨代謝。在明顯富集的信號通路中仍存在部分調(diào)控其他系統(tǒng)的信號通路，如P13K-Akt信號通路、FoxO信號通路、NF-KB信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子3信號通路、泌乳素信號通路和甲狀腺素信號通路等。PI3K/Akt通路能促進間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)遷移。PI3K通過激活A(yù)kt，進而增加Ras同源基因家族A的表達量，從而改變細胞骨架[25]。研究證實FOXOs因子可通過提高細胞的抗氧化能力從而減緩癌癥、心血管疾病、骨質(zhì)疏松等年齡相關(guān)疾病的發(fā)展[26-29]。NF-κB信號通路是聯(lián)系細胞因子、炎癥反應(yīng)的橋梁，多種炎癥相關(guān)疾病與NF-κB信號通路的過度激活有關(guān)，NF-κB信號通路不僅在骨形成和骨吸收起著重要作用，而且通過與其他信號通路相互聯(lián)系，彼此作用，影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生[30]。神經(jīng)營養(yǎng)因子3(Neurotrophin)可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路的表達，從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化[31]。泌乳素可通過對骨轉(zhuǎn)化的直接作用削弱骨的形成和礦化以及負反饋機制使GnRH的分泌失調(diào)而參與骨代謝的調(diào)節(jié)[32]。

綜上所述，體內(nèi)代謝之間是相互作用、相互聯(lián)系的，通過全身其他系統(tǒng)，如循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種代謝可以間接影響或干預(yù)骨微環(huán)境，進而促進成骨細胞增殖或抑制破骨細胞生成以及雙向調(diào)節(jié)，故杜仲治療OP應(yīng)在針對局部關(guān)鍵通路的基礎(chǔ)上，仍應(yīng)針對疾病病因、所處機體環(huán)境，進行多靶點、多系統(tǒng)干預(yù)，這與中醫(yī)多靶點、多方面的綜合干預(yù)理念相吻合。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析手段為后續(xù)進一步探討機制和實驗設(shè)計的優(yōu)化等提供了重要的基礎(chǔ)，使實驗研究更加合理、更加具有指導(dǎo)性。