烏司他丁預(yù)處理對肝缺血再灌注大鼠急性腎損傷的預(yù)防作用

崔龍海,李浩,韓龍哲,李哲浩

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

肝臟缺血-再灌注(I/R )損傷是全身性的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制尚未完全闡明。肝移植及肝癌切除術(shù)中常需阻斷肝臟血流降低術(shù)中大出血的風(fēng)險(xiǎn)，但常影響肝臟及肺臟、心臟、腎臟、小腸、胰腺等遠(yuǎn)端器官的功能[1，2]。I/R時(shí)肝臟及門靜脈可產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素、過氧化產(chǎn)物、腫瘤壞死因子(TNF-α)和其它炎癥介子[3,4]等有害介質(zhì)，肝血流恢復(fù)后有害介質(zhì)可導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官發(fā)生急性功能損害。I/R 導(dǎo)致的腎臟損傷嚴(yán)重影響患者手術(shù)效果及生存率[5]。谷胱甘肽(GSH )、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)含量以及尿量是評估肝腎功能的指標(biāo)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)是常用的氧化應(yīng)激指標(biāo)。烏司他丁(UTI)是從健康成年男性尿液中提取純化得到的一種廣譜蛋白酶抑制劑，能同時(shí)抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、彈性蛋白酶等多種酶的活性、抑制炎性介質(zhì)過度釋放、清除氧自由基，對重要臟器缺血性損傷具有保護(hù)作用[6，7]。白細(xì)胞介素18(IL-18)是一種致炎因子，缺血性組織中常表達(dá)升高，過度表達(dá)可導(dǎo)致局部組織繼發(fā)性損傷[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，血清IL-18和急性腎損傷(AKI)危重患者的住院死亡率有關(guān)，IL-18是AKI早期特異性的生物標(biāo)志物之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝臟I/R損傷模型大鼠血清IL-18水平與ALT、AST活性均升高，尿量降低，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究觀察了UTI預(yù)處理對肝I/R大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用，并探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級Wistar大鼠30只(延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g。IL-18、TNF-α試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，UTI注射針劑為廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠分組及UTI給藥方法 大鼠在IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù) (SO)組、I/R組、UTI組。UTI組造模前30min預(yù)處理 3萬 U/kg UTI(2 mL無菌生理水溶解，右側(cè)隱靜脈給藥)，SO組和I/R組給予等體積生理鹽水。I/R組、UTI組采用Pringle法制備大鼠肝臟I/R損傷模型：所有實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前禁食12 h、10%水合氯醛麻醉、常規(guī)消毒、隱靜脈置管。取腹部正中于尖突下0.5 cm處縱向切約3 cm長的切口，暴露肝門。I/R組和UTI組參照Pringle法阻斷肝臟血流30 min，再灌注2 h。SO組僅解剖分離肝十二指腸韌帶。

1.3 觀察指標(biāo) 造模后復(fù)流2 h，處死各組大鼠，下腔靜脈采集血液、低溫離心分離血清、-80 ℃保存。取肝臟、腎臟組織，采用比色法檢測血清和肝腎組織Cr、BUN、ALT、AST、GSH、GSH-Px、SOD、MDA。采用ELISA法測定血清和腎組織IL-18、TNF-α。行膀胱穿刺并收集測算三組尿液體積，HE染色法觀察肝、腎臟組織病理學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 三組血清ALT、AST活性和BUN、Cr含量變化 見表1。

表1 三組血清ALT、AST活性和BUN、Cr含量變化

注：與SO組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

2.2 三組血清和腎組織IL-18、TNF-α含量及尿量比較 見表2。

2.3 三組清SOD和腎組織、GSH-Px、GSH、MDA含量變化 見表3。

表2 三組血清和腎組織IL-18、TNF-α含量及尿量比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

表3 各組大鼠血清SOD和腎組織、GSH-Px、GSH、MDA含量變化

注：與SO組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05。

2.4 三組肝臟、腎臟組織形態(tài)學(xué)變化 SO組肝臟組織細(xì)胞索排列有序，組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)基本正常。I/R組肝臟組織細(xì)胞索排列無序，有明顯的細(xì)胞壞死灶，炎性細(xì)胞聚集成團(tuán)。UTI組肝臟病變明顯輕于I/R組。見圖1。SO組腎臟組織細(xì)胞形態(tài)基本正常。I/R組腎臟組織腎小球及腎間質(zhì)水腫，腎小管上皮水腫、擴(kuò)張、變形。UTI組腎臟病變程度輕于I/R組。見圖2。

注:箭頭處為壞死灶

圖1三組肝臟組織病理學(xué)變化(×100)

注：箭頭處為壞死灶

圖2三組腎臟組織病理學(xué)變化(×100)

3 討論

肝I/R損傷是肝臟外科手術(shù)、休克、創(chuàng)傷以及器官移植中常見的病理過程，缺血期鈣超載、氧自由基的大量產(chǎn)生、生物膜的破裂、各種酶的漏出和炎性介質(zhì)大量釋放等均與其有關(guān)[10]，其中氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在I/R損傷過程中起重要的作用。灌流不足可導(dǎo)致腎臟缺血，腎小球?yàn)V過率降低，從而發(fā)生急性腎功能障礙。肝I/R損傷可引起再灌注后綜合征，急性腎損傷是其中的一個(gè)重要并發(fā)癥[11，12]。Kupffer 細(xì)胞是肝內(nèi)數(shù)量最多的定居巨噬細(xì)胞，在Toll 樣受體的參與下Kupffer 細(xì)胞激活炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，其中TNF-α對觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)起重要作用，TNF-α附著于肝細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子、活性氧族及NF-κB等，直接造成肝損傷。而且聚集細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)，并激活中性粒細(xì)胞進(jìn)入缺血后的肝臟，損傷肝細(xì)胞[13]。IL-18具有多種組織免疫活性，肝I/R時(shí)由肝臟Kuffer 細(xì)胞以及肝外巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，缺血性組織中表達(dá)升高[14]。IL-18的過度表達(dá)可延遲移植腎的功能恢復(fù)[15]，IL-18是少尿型急性腎損傷早期特異性的生物標(biāo)志物。本研究中，I/R組大鼠血清和腎組織IL-18、TNF-α表達(dá)明顯高于SO組，且隨IL-18含量升高而尿量減少。鏡下可見I/R組大鼠肝組織存在明顯肝細(xì)胞壞死灶,并伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤，腎小球水腫以及腎小管上皮水腫、變形、擴(kuò)張。表明IL-18、TNF-α等炎癥因子的過度產(chǎn)生及IL-18、TNF-α等誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種細(xì)胞毒性可能是造成肝I/R后繼發(fā)急性腎損傷的直接原因。

肝臟I/R時(shí)由于組織細(xì)胞缺血缺氧和ATP分解增加，以及其分解產(chǎn)物在缺血組織內(nèi)大量堆積，使氧自由基在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增多，引起生物膜脂質(zhì)過氧化。由于脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)膜的完整性受到破壞，改變膜的流動性和通透性，造成微循環(huán)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)包括細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和非酶性抗氧化劑，SOD和GSH-Px 是內(nèi)源性抗氧化酶，其活性高低反映組織清除氧自由基的能力。GSH是人類細(xì)胞質(zhì)中自然合成的一種肽，在過氧化物酶的作用下，通過巰基氧化分解體內(nèi)的超氧基團(tuán)，中和氧自由基對組織的損害，并能轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸性物質(zhì)，加速自由基的排泄[16]。MDA是氧自由基攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，組織中的含量可反映脂質(zhì)過氧化程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果I/R組大鼠血清和腎組織SOD、GSH-Px 活性和GSH含量均低于SO組，MDA含量高于SO組。表明抗氧化物質(zhì)的減少和氧自由基的大量產(chǎn)生是肝I/R后急性腎損傷的重要原因，后者過度產(chǎn)生會加重組織繼發(fā)性損傷。

UTI是肝臟分泌的一種機(jī)體內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，具有廣泛的抑酶譜，能夠抑制蛋白酶活性，抑制IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、血小板活化因子等細(xì)胞因子的釋放，穩(wěn)定溶酶體膜，減輕微循環(huán)障礙和全身炎癥反應(yīng)綜合征，維持氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡從而減輕缺血性組織損傷，改善腎小球?yàn)V過功能和腎小管重吸收[17～19]。有臨床觀察報(bào)道，UTI對急性腎損傷有較好的療效，縮短ICU住院時(shí)間，降低死亡率[20]。有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，UTI通過促進(jìn)細(xì)胞增殖加快受損細(xì)胞的修復(fù)，減少毛細(xì)血管通透性，減少血管內(nèi)液向組織轉(zhuǎn)移，減輕組織水腫[21]。本研究中，與I/R組比較，UTI組大鼠血清和腎組織中IL-18、TNF-α 表達(dá)下調(diào)，ALT、AST酶活性和BUN、Cr、MDA含量降低，尿量和SOD、GSH-Px、GSH含量增多，肝腎組織病理學(xué)改變明顯減輕。表明UTI對肝I/R后繼發(fā)腎損傷具有保護(hù)作用。猜測其可能作用機(jī)制為，UTI通過減弱肝I/R對Kuffer細(xì)胞的刺激，下調(diào)IL-18、TNF-α水平及增加尿量等途徑減輕肝I/R后急性腎損傷。 同時(shí)UTI可抑制IL-18誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等各類炎癥因子的過度產(chǎn)生和釋放；阻斷IL-18、IL-6、NF-κB、FN-γ、TNF-α 等炎癥因子的級聯(lián)效應(yīng)；提高機(jī)體抗氧化能力、改善微循環(huán)及增加尿量等途徑減輕肝I/R后急性腎損傷。

綜上所述，UTI預(yù)處理可有效減輕大鼠肝I/R后急性腎損傷，其機(jī)制可能與UTI抑制IL-18、TNF-α等表達(dá)，促進(jìn)GSH 、GSH-Px、SOD表達(dá)有關(guān)。