結(jié)直腸癌組織中癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)變化及其意義

段佳文，林楊 ，郭飛，屈明，薛軍

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院,河北張家口0750002；2河北北方學(xué)院研究生院)

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重危害人群健康的惡性腫瘤。近年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)為主，強(qiáng)調(diào)早發(fā)現(xiàn)、早治療。特異性、準(zhǔn)確性較高的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有極其重要的價(jià)值[1,2]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子-1(CEACAM-1)作為癌胚抗原家族重要成員之一，能調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，同時(shí)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附，還參與血管和淋巴管新生等病理過程[3,4]。CEACAM-1在乳腺癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)[5,6]，而在結(jié)直腸癌中的表達(dá)相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了50例份結(jié)直腸癌組織CEACAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年1月間我院收治的50例原發(fā)性直腸癌患者，其中其中男27例、女23例,年齡35～71(52.3±9.0)歲；TNM分期為Ⅰ期2例、Ⅱ期9例、Ⅲ期27例、Ⅳ期12例。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診，均為原發(fā)性肝癌，未進(jìn)行術(shù)前新輔助放化療，且病例資料完整無誤。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行新輔助放化療治療，復(fù)發(fā)性肝癌，有心腦血管疾病及其他手術(shù)禁忌證等。50例患者均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)中保留癌組織(觀察組)及癌旁組織(對(duì)照組，至癌灶邊緣至少10 cm處且經(jīng)病理診斷確診為正常組織)標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 兔抗人濃縮型CEACAM-1單克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中杉公司，RM-2245組織切片機(jī)購于德國(guó)LEICA公司，Odyssey雙色紅外熒光成像儀購于德國(guó)LI-COR公司，TRIzol試劑購于美國(guó)Invitrogen公司，DEPC水購于美國(guó)Sima公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購于上海基星生物科技有限公司。

1.3 CEACAM-1 mRNA檢測(cè)方法 采用RT-PCR法。提取總RNA濃度，設(shè)計(jì)CEACAM-1上游引物：5′-CAGTCACCTTGAATGTCACCTATG-3′，下游引物：5′-GTTCCATTGATAAGCCAGGAGTAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；反應(yīng)體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，cDNA模板2 μL，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μL，RNA 酶抑制劑1 μL，反應(yīng)總體積25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)，2%瓊脂糖凝膠后電泳。以2-△△Ct代表CEACAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 CEACAM-1蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)CEACAM-1蛋白。取兩組標(biāo)本，石蠟包埋后4 μm切片，脫蠟水化，沖洗后滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù)，冰水中冷卻，PBS沖洗，3%的H2O2室溫封閉，PBS沖洗，滴加CEACAM-1一抗(1∶200)。每張切片50 μL，4 ℃過夜。PBS沖洗，滴加特異性二抗，室溫下DAB顯色，PBS沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明，樹膠封片，陰性對(duì)照為PBS代替一抗，光鏡下觀察。CEACAM-1陽性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕色或棕黃色顆粒且染色程度大于25%的細(xì)胞為CEACAM-1陽性細(xì)胞，計(jì)算兩組陽性表達(dá)率。陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 隨訪方法 術(shù)后隨防至2017年12月31日，隨訪方法為定期復(fù)查、電話隨訪。

2 結(jié)果

觀察組、對(duì)照組CEACAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.08、0.20±0.05，二者比較，P<0.05；觀察組、對(duì)照組CEACAM-1蛋白陽性表達(dá)率分別為68.00%(34/50)、28.00%(14/50)，二者比較，P<0.05。CEACAM-1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。CEACAM-1表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等有關(guān)(P均<0.05)。

中位隨訪時(shí)間56個(gè)月，50例患者中23例生存，27例死亡。 死亡、生存患者CEACAM-1的陽性表達(dá)率分別為88.89%(24/27)、43.48%(10/23)，二者比較，P<0.05。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，CEACAM-1表達(dá)陽性和陰性患者的生存函數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.394，P=0.031)，即CEACAM-1表達(dá)和患者生存時(shí)間相關(guān)，CEACAM-1陽性患者預(yù)后較差。

表1 結(jié)直腸癌組織中CEACAM-1蛋白的表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

Cox回歸模型分析顯示，CEACAM-1表達(dá)、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(95%CI分別為1.365～1.917，1.725～2.363，1.041～1.620，1.160～1.741；P均<0.05)。

3 討論

CEACAM-1是一種跨膜糖蛋白，屬于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，最初是由Ocklind等[7]在研究木瓜蛋白酶質(zhì)膜的不溶性成分的某些作用和功能時(shí)被發(fā)現(xiàn)，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中都有較為廣泛的分布。CEACAM-1基因定位于人類染色體的19q13.2區(qū)域，該基因的組成是由9個(gè)外顯子按特定序列排列而成，第1個(gè)含ATG啟動(dòng)子，第2個(gè)負(fù)責(zé)編碼IgV樣結(jié)構(gòu)域，第3至5個(gè)外顯子則用于編碼IgC2樣結(jié)構(gòu)域，第6個(gè)編碼TM跨膜區(qū)，第7個(gè)包含53個(gè)bp，可通過選擇性剪接產(chǎn)生CEACAM-1-L、CEACAM-1-S長(zhǎng)短兩種不同的亞型，較長(zhǎng)的CEACAM-1-L包含第 7、8個(gè)外顯子，由72～74個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，而較短的CEACAM-1-S則由12～14個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，僅含第9個(gè)外顯子TGA-S[8]。CEACAM-1-L胞內(nèi)段含有2個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序通過其磷酸化參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抑制下游信號(hào)的作用，而CEACAM-l-S則無此基序，但含有結(jié)合鈣調(diào)蛋白、原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)域，對(duì)細(xì)胞骨架有調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞表面CEACAM-1-L主要以一種順式同源二聚體的形式存在，不同活化狀態(tài)下的細(xì)胞二聚體不同，可能參與不同的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，CEACAM-1-L還可以在細(xì)胞間形成反式二聚體，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附[9]。

CEACAM-l還可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞分化，對(duì)胰島素代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理過程具有重要作用。研究[10]證實(shí)，CEACAM-1參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)過程，其異常表達(dá)可能是引起和維持結(jié)直腸癌惡性表型的原因之一。此外，CEACAM-1還與脈管結(jié)構(gòu)形成有不可分割的關(guān)系，這其中就包括對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用的血管、淋巴管生成過程[11,12]。CEACAM-1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的關(guān)系極為密切，是VEGF的一個(gè)重要效應(yīng)分子。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM-1的高表達(dá)會(huì)引起VEGF、VEGFR-2、angiopoietin-1等血管生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，進(jìn)而形成微血管，而當(dāng)使用抗體抑制CEACAM-1后，相應(yīng)的VEGF介導(dǎo)的微血管轉(zhuǎn)化也收到抑制[13]。Yurdakul等[14]研究顯示，CEACAM-1在腫瘤組織的淋巴管內(nèi)皮中常有表達(dá)，可能是腫瘤新生淋巴管的標(biāo)志物。Horst等[15]的小鼠模型實(shí)驗(yàn)論證了在調(diào)節(jié)微淋巴管重建的過程中，內(nèi)皮細(xì)胞上的CEACAM-1表達(dá)起到了重要作用，相反基質(zhì)膠阻塞試驗(yàn)及后肢缺血模型的新生毛淋巴管重建的失敗正是由CEACAM1的缺少造成。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組CEACAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁組織，表明CEACAM-1高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌變的發(fā)生和發(fā)展，且CEACAM-1表達(dá)越高，其對(duì)周圍組織器官的侵襲能力越強(qiáng)，肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大，TNM分期越晚。吳濤等[16]研究證實(shí)結(jié)直腸癌組織中CEACAM-1參與腫瘤微血管的生成及血管浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。申寶鳴等[17]報(bào)道大腸癌患者的血清中CEACAM-1水平明顯超過正常組，CEACAM-1很可能是大腸癌早期診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。進(jìn)一步研究顯示CEACAM-1與結(jié)直腸癌患者的生存期相關(guān)，CEACAM-1表達(dá)越高，其生存期越短，預(yù)后越差，CEACAM-1表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。

綜上所述， 結(jié)直腸癌組織中存在CEACAM-1高表達(dá)。CEACAM-1的表達(dá)異常在結(jié)直腸癌病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CEACAM-1可能與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)。