過敏性紫癜患兒外周血單核細胞Toll樣受體2的表達變化及意義

朱海濤，呂進泉，王秋霞，相虹

(江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212000)

過敏性紫癜(HSP)是一種兒童常見的血管變態性出血性疾病，臨床表現主要為非血小板減少性紫癜、關節腫痛、腹痛及腎臟損傷(以蛋白尿或血尿為主)[1]。紫癜性腎炎(HSPN)是HSP的常見并發癥，嚴重影響HSP的病程及預后[2]。目前HSP的病因及發病機制尚未完全闡明，免疫功能紊亂、體液免疫異常導致大量免疫球蛋白(Ig)A的沉積是HSP重要致病因素這一論點普遍為學者所接受[3]。HSP 患者的細胞免疫功能紊亂主要表現在急性期外周血中T淋巴細胞亞群異常，CD4+T/CD8+T 比值下降(即CD4+T細胞數量降低，CD8+T細胞數量增高)，其中Th1/Th2 免疫應答失衡，即Th1功能降低，Th2優勢活化[4]。Toll 樣受體(TLRs)可通過識別病原微生物表面上各種不同的病原模式相關分子，激活細胞內信號轉導通路級聯反應，最終產生一系列炎癥細胞因子[5]。TLRs的激活誘導了Th1型適應性免疫應答, 在這一過程中產生干擾素 (IFN-γ)的CD4+T細胞占優勢。TLR的激活誘導如白細胞介素12(IL-12)、IL-23和IL-27等細胞因子的表達, 促使未成熟前體細胞Th0向Th1細胞分化, 并且抑制Th2細胞分化, 在向Th2細胞分化過程中分泌IL-4、IL-5和IL-13, 但不分泌IFN-γ[6，7]。TLR2受體在Toll樣受體家族中表達范圍最廣，是識別病原微生物種類最多的成員，它可觸發機體對致病微生物的級聯免疫應答，已經成為多種疾病治療的新靶點[8]。本研究觀察了HSP患兒外周血TLR2的表達變化，并分析其在Th1/Th2免疫應答過程中的作用。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年3月～2017年11月間于我院住院治療的71例HSP患兒，其中男40例、女31例。納入標準：①符合2006年歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)和歐洲兒科風濕病學會(PReS)制定HSP診斷標準[9]。②首次發病且患兒年齡≤14歲。③近1個月內未接受過任何肝素、糖皮質激素類和免疫抑制劑類藥物的治療。排除標準：①既往或目前患有原發性腎臟疾病，如腎病綜合征、Ig A 腎病、腎小球腎炎等。②存在如系統性紅斑狼瘡等免疫性疾病引起的腎臟損害。③有血小板減少性紫癜，血友病、白血病等血液系統疾病。根據2009年中華醫學會兒科學分會腎臟病學組的紫癜性腎炎的診治循證指南(試行)中的診斷標準[10]，將71例患兒分為無腎損害者(NHSPN)及有腎損害者(HSPN)。NHSPN35例中男19例，女16例；年齡4～13(6.56 2.26)歲。HSPN36例中男21例，女15例；年齡3～13(5.98 2.98)歲。另選同期在我院志愿參加研究的35例健康兒童作為對照組，男20例，女15例；年齡3～13(5.66 2.53)歲。三組患兒在性別、年齡上差異具有可比性。本研究獲得醫院醫學倫理委員會討論通過，所有納入者均征得家屬知情同意。

1.2 外周血單核細胞(PBMCs)中TLR2 mRNA檢測方法 收集納入者靜脈血3 mL，無菌肝素抗凝，無菌狀態下密度梯度離心，得到PBMC。采用RT-PCR法檢測PBMC中TLR2 mRNA：TRIzol提取RNA，測定RNA濃度及純度，逆轉錄合成cDNA，進行熒光定量PCR反應檢測目的基因TLR2的mRNA(以GADPH作為內參蛋白),以2-△△Ct代表TLR2 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 外周血CD14+單核細胞表面TLR2蛋白檢測方法 收集納入者靜脈血3 mL，采用流式細胞術檢測外周血CD14+單核細胞表面TLR2蛋白：分別取100 L外周靜脈血，加入5 L CD14-FITC抗體，測試管加入5 L TLR2-PE抗體，對照管中加入5 L PE標記的Mouse IgG2 抗體，37 ℃避光孵育15 min，加入3 mL溶血素混勻，靜置15 min后1 500 rpm離心5 min，PBS洗滌2次，300 L PBS重懸，Cytomics FC500 型流式細胞儀上檢測TLR2陽性細胞所占比例。

1.4 外周血IFN-γ、IL-4檢測方法 抽取納入者空腹靜脈血3 mL，采用酶聯免疫吸附法測量血清IFN-γ、IL-4。按照IL-4試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)和IFN-γ試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)說明書的步驟進行實驗，分別在450 nm處讀取待測物的光密度(OD)值，繪制標準曲線后得到每個待測樣品血清中IFN-γ、IL-4含量。

2 結果

HSPN、NHSPN及對照組PBMCs 中TLR2 mRNA的相對表達量分別為1.97±0.76、1.50±0.70、1.11±0.52，兩兩比較,P均<0.05。HSPN、NHSPN及對照組外周血CD14+單核細胞表面TLR2蛋白含量分別為0.44±0.29、0.19±0.12、0.09±0.06，兩兩比較,P均<0.05。三組血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較見表1。

表1 三組受血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與NHSPN相比，#P<0.05。 HSP患兒CD14+單核細胞表面TLR2蛋白蛋白表達與血清IFN-γ水平呈負相關(r=-0.906,P=0.000)；與IL-4水平呈正相關(r=0.994，P=0.000)。

3 討論

HSP是一種以全身小血管炎癥為主要病變的臨床綜合征，20%以上的HSP患兒都伴隨著腎損傷的發生[11]。目前HSP的發病機制尚未完全明確，目前公認的主要發病機制包括T淋巴細胞功能失調、體液免疫異常和細胞因子分泌異常的免疫功能紊亂。除此之外，炎癥介質、凝血與纖溶機制等多方面因素可能共同參與了HSP的發病發展過程。HSP病情的發展與T淋巴細胞的免疫功能紊亂緊密相關。成熟的T淋巴細胞包括CD4+、CD8+兩個細胞亞群。研究[12]發現，HSP患兒體內外周血中細胞因子微環境發生變化后導致CD4+T細胞數量降低，而CD8+T細胞數量增高，CD4+/CD8+比值明顯降低，表明CD4+/ CD8+T細胞比例失衡可能是參與HSP發病的因素之一。將CD4+T淋巴細胞按照分泌的細胞因子及其功能的不同，分為Th1、Th2、Th17和調節性T細胞(Treg)四個亞群。正常情況下Th1和Th2之間動態的調節使得機體免疫處于動態平衡。如果這種平衡遭受破壞，就可能會導致免疫功能調節紊亂，進而引起疾病。Th1細胞可分泌IFN-γ、IFN-γ及IL-12等細胞因子。巨噬細胞經IFN-γ刺激后會釋放大量IL-12，刺激其他Th0細胞向Th1型分化，并抑制其向Th2型分化，構成正反饋通路。Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等與抗體產生和抑制的細胞因子。IL-4一方面通過誘導B細胞表面抗原CD23的表達來促進B細胞的活化并促進IgE等合成過程、下調IFN-γ的分泌，使得機體處于慢性持續性炎癥的狀態。另一方面IL-4可通過抑制Th1細胞的活化，從而促使Th0細胞分化成Th2型，進而Th2繼續大量分泌IL-4，形成正反饋調劑機制，促進免疫反應的發生[13]。故IL-4是將體液免疫和細胞免疫聯系起來的細胞因子。而B淋巴細胞的活化，可促進B細胞分泌的免疫球蛋白向IgA轉化，從而患兒體內IgA水平增高。進一步地，IgA和IgA免疫復合物逐漸沉積在小血管中，從而損傷血管內皮引起炎癥反應，從而加重HSP的疾病進展[14，15]。本研究結果發現，HSP患兒PBMCs中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值低于對照組，IL-4水平高于對照組，且HSPN組中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值顯著低于NHSPN組，IL-4水平顯著高于NHSPN組，說明HSP患兒存在Thl /Th2免疫失衡和Th2過度活化的現象，Th2活化可能與腎損傷緊密相關。

TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可識別內源性或外源性配體，通過信號傳導途徑分別激活轉錄因子誘導炎癥細胞因子、趨化因子基因轉錄。當傳導途徑異常活化時，可干擾機體自身免疫機制，導致免疫功能紊亂[16]。TLRs在調節Th1/Th2免疫平衡中的作用：一方面，TLRs通過信號轉導途徑與MyD88蛋白共同參與Thl/Th2的調節反應。有研究[17]表明，用脂多糖(LPS)刺激去除小鼠樹突狀細胞的MyD88蛋白后可誘導T細胞分泌IL-4而不能分泌IL-12和IFN-γ，即表現為Th1反應缺陷；另一方面，TLRs通過配體參與Th1/Th2的調節反應，有研究發現TLR2與配體結合后可誘導Th2型細胞因子分泌IL-4，導致Th2型免疫應答反應[18]。Zhao等[19]發現，TLR2、TLR4可在炎癥模型中誘導Th2型免疫應答反應。

本研究結果，與對照組比較，HSP患兒PBMCs中的TLR2 mRNA及蛋白表達水平均升高，HSPN TLR2的基因及蛋白表達顯著高于NHSPN。結果提示HSP患兒中TLR2表達水平顯著增加，且有腎損傷的HSP會伴隨著TLR2的過度激活。同時本研究還發現HSP患兒PBMC中的TLR2蛋白表達與血清IFN-γ水平呈負相關，與IL-4水平呈正相關。說明HSP患兒中TLR2可能參與到Thl/Th2的調節反應中，參與IFN-γ和IL-4的分泌調節并使Th2型免疫應答反應上調。

綜上所述， HSP患兒外周血PBMCs 中TLR2表達升高，且HSPN患兒外周血PBMCs 中TLR2表達升高更明顯。TLR2可能通過降低IFN-γ水平、升高IL-4水平參與HSP的腎損傷。