microRNA-124高表達(dá)對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K1侵襲、遷移的影響及其機(jī)制

肖成華,闞捷,李海燕,贊梅,王新國

(青海省人民醫(yī)院,西寧810007)

甲狀腺乳頭狀癌(TPC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，約占內(nèi)分泌腫瘤的95%，全球發(fā)病率逐年升高[1]。侵襲周圍頸部組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征，嚴(yán)重影響PTC生存率[2]。探尋TPC侵襲、轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，尋找預(yù)測TPC侵襲、轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物及干預(yù)治療靶點(diǎn)，對提高TPC患者的治愈率、生存率具有重要意義。微小RNA(MicroRNA)能夠與mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合，降解mRNA或者抑制其翻譯[3]。MicroRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和侵襲等細(xì)胞進(jìn)程[4]。近年研究[5]證實(shí)，microRNA-124是一種重要的抑癌基因，在胃癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低或表達(dá)丟失。在前列腺癌組織中microRNA-124可抑制TGF-α介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。外源性增加microRNA-124表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移[6]。但TPC細(xì)胞中microRNA-124的功能、分子機(jī)制及其內(nèi)在的細(xì)胞靶向分子并未被完全闡明。含IQ基元GTP酶激活蛋白1(IQGAP1)是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，含有多個(gè)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，能夠與細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞骨架成分以及多種信號通路蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期等細(xì)胞功能。2017年1月～2018年1月，我們觀察了microRNA-124高表達(dá)對TPC細(xì)胞系K1侵襲、遷移的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 TPC細(xì)胞系K1、BCPAP、TPC-1及正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori3-1來自中國上海科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)中培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司，microRNA-124 mimics(促進(jìn)microRNA-124表達(dá))及microRNA無關(guān)序列(microRNA-124 NC)來自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1細(xì)胞microRNA-124檢測方法 采用Real-time PCR法。取適量K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度及純度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩icroRNA-124上下游引物分別為5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′；5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′，以GAPDH為內(nèi)參，上下游引物分別為5′-TCTCTGCTCCTCCTGTT-3′；5′-ACTCCGACCTTCACCTT-3′。K1、BCPAP、TPC-1及Nthy-ori3-1細(xì)胞microRNA-124的相對表達(dá)量分別為1.05±0.06、2.31±0.11、1.65±0.09、3.48±0.12，與Nthy-ori3-1比較， K1、BCPAP、TPC-1 microRNA-124相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)；PTC細(xì)胞系中，K1的microRNA-124相對表達(dá)量最低，因此選擇K1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 K1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及和轉(zhuǎn)染方法 取4×104個(gè)處于對數(shù)生長期的K1細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為觀察組、對照組、空白組，觀察組、對照組采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染microRNA-124 mimics、microRNA-124 NC,操作步驟均參照試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行。空白組不做任何處理。

1.4 K1細(xì)胞侵襲情況觀察 采用Transwell試驗(yàn)。取適量兩組細(xì)胞，將Matrigel基質(zhì)膠從-80 ℃冰箱中取出，4 ℃冰箱過夜融化。DMEM無血清培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠至濃度為4.0 μg/μL，取50 μL加入至Transwell小室，放置6 h；凝固后取150 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè))至Transwell小室中，在下室中加入500 μL DMEM培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液對Transwell小室多孔膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行染色，蒸餾水洗滌后，顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞侵襲情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野，記錄每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目，取平均值為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.5 K1細(xì)胞遷移情況觀察 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。以6×105/孔的密度，將對數(shù)生長期兩組細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，用移液器槍頭垂直于底部均勻劃線，每孔至少劃3條平行線；PBS緩沖液洗滌，去除劃下細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照觀察，培養(yǎng)24 h再次置于顯微鏡下拍照觀察，計(jì)算細(xì)胞劃痕24 h的劃痕愈合百分比。愈合百分比=(1-24 h劃痕間距/0 h劃痕間距)×100%,取平均值。

1.6 K1細(xì)胞IQGAP1 mRNA及microRNA-124檢測 采用Real-time PCR法。取對數(shù)生長期兩組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-80 ℃保存?zhèn)溆谩icroRNA-124及GAPDH的引物序列見“1.3”，IQGAP1上下游引物分別為5′-AGAACGTGGCTTATGAGTACCT-3′；5′-CCAGTCGCCTTGTATCTGGT-3′。以2-ΔΔCt表示IQGAP1 mRNA及microRNA-124的相對表達(dá)量。

1.7 K1細(xì)胞IQGAP1 蛋白檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期兩組細(xì)胞。RIPA蛋白裂解液抽提細(xì)胞全蛋白，檢測蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE膠分離蛋白，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，加入兔抗人IQGAP1多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體，室溫孵育1 h，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進(jìn)行觀察，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 K1細(xì)胞中含有IQGAP1基因3′UTR報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性檢測 采用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)。將IQGAP1基因3′-UTR片段克隆至pGL3-Basic載體，構(gòu)建pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的操作步驟，將microRNA-124 mimics/NC、報(bào)pGL3-Basic- IQGAP1-3′-UTR(pGL3-Basic空載體為對照)、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞。培養(yǎng)48 h參照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書的操作步驟，檢測兩組熒光素酶活性。計(jì)算pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的相對熒光素酶活性，即螢火蟲熒光素酶活性與內(nèi)參海腎熒光素酶的活性的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較 培養(yǎng)24 h時(shí)觀察組、對照組、空白組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(104.32±11.21)、(304.27±20.83) 、(299.38±18.32)個(gè)，觀察組細(xì)胞侵襲數(shù)低于對照組和空白組(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞劃痕愈合百分比比較 培養(yǎng)24 h時(shí)觀察組、對照組、空白組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(62.16±3.21)、(104.27±6.83)、(99.38±5.32)，觀察組劃痕愈合百分比低于對照組和空白組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞IQGAP1 mRNA及蛋白 、microRNA-124 相對表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞IQGAP1 mRNA及蛋白 、microRNA-124相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，#P均<0.05；與空白組比較，＊P<0.05。

2.4 各組基因質(zhì)粒的相對熒光素酶活性比較 培養(yǎng)48 h觀察組、對照組、空白組基因質(zhì)粒的相對熒光素酶活性分別為0.24±0.06、1.06±0.15、1.10±0.17， 觀察組相對熒光素酶活性低于對照組和空白組(P均<0.05)。

3 討論

microRNA參與調(diào)控約60%的蛋白編碼基因，而microRNA表達(dá)紊亂可導(dǎo)致糖尿病、惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生。近年來，大量研究[7]結(jié)果表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，microRNA發(fā)揮著類似抑癌基因或者促癌基因的功能，肝細(xì)胞癌中microRNA-337參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路活性，并可調(diào)節(jié)HMGA2基因表達(dá)，促進(jìn)惡性進(jìn)展，發(fā)揮促癌基因功能，而microRNA-425可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移，在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌基因功能。TPC細(xì)胞中存在多種microRNA的表達(dá)異常，如microRNA-363-3p在TPC腫瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平均降低，發(fā)揮抑癌基因功能[8]，而microRNA-96[9]等則可促進(jìn)TPC腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等惡性進(jìn)展過程，發(fā)揮促癌基因功能。然而microRNA在TPC發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在分子機(jī)制尚不十分明確。探尋microRNA在TPC中的作用機(jī)制，有利于更深層次的認(rèn)知TPC，并且為TPC的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

MicroRNA-124在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌以及甲狀腺癌中表達(dá)顯著下降，Zhang等[10]研究結(jié)果表明， microRNA-124通過阻滯PRRX1基因表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性。MicroRNA-124作為一種抑癌基因，其異常表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，如在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中，microRNA-124參與并且促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展，可以作為腫瘤患者不良預(yù)后的生物標(biāo)記物。microRNA-124可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，如在肺癌細(xì)胞中，microRNA-124靶向抑制MYO10基因表達(dá)[11]，在膀胱癌細(xì)胞中，microRNA-124能夠靶向調(diào)節(jié)R℃K1基因表達(dá)，降低細(xì)胞侵襲遷移能力。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，microRNA-124在TPC細(xì)胞系中相對表達(dá)量均低于正常甲狀腺細(xì)胞系，提示microRNA-124表達(dá)下降可能參與并促進(jìn)了TPC的腫瘤形成過程，且可能發(fā)揮抑癌基因功能，Zhang 等[12]在膀胱癌細(xì)胞HT1197 中增加microRNA-124表達(dá)后，導(dǎo)致其體外成瘤速率下降。本研究結(jié)果表明，外源性增加microRNA-124表達(dá)后，K1細(xì)胞的侵襲和遷移能力均顯著下降，其他研究者在胃癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中促進(jìn)microRNA-124的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力均降低，共同證實(shí)microRNA-124可發(fā)揮抑癌基因功能，抑制TPC腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移等惡性生物學(xué)活性。

microRNA-124的靶基因有STAT3、EZH2等，在細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲遷移等過程中發(fā)揮作用。而microRNA-124通過何種途徑影響TPC細(xì)胞侵襲遷移過程，尚無報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在K1細(xì)胞中增加microRNA-124表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)IQGAP1的mRNA及蛋白水平均降低，初步推測IQGAP1可能是microRNA-124的下游靶基因，進(jìn)一步地，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，microRNA-124能夠降低pGL3-Basic-IQGAP1-3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，證實(shí)microRNA-124可特異性靶向抑制IQGAP1基因表達(dá)。

IQGAP1能夠結(jié)合一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用的蛋白，如Rac1、Cdc42，激活Wnt/β-catenin、MAPK信號通路，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[13]。IQGAP1可以直接與E-cadherin結(jié)合，抑制E-cadherin的功能，減弱細(xì)胞之間的黏附作用，促進(jìn)TPC細(xì)胞的侵襲、遷移[14]。本研究中，外源性增加K1細(xì)胞中microRNA-124表達(dá)后，導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，可能是microRNA-124通過下調(diào)IQGAP1基因表達(dá)，抑制其參與各種信號通路和EMT過程所致。MicroRNA-124參與調(diào)控眾多靶基因，本研究并未對IQGAP1以外的基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，雖然在其他腫瘤中，有大量關(guān)于IQGAP1參與調(diào)控侵襲遷移的機(jī)制研究，但尚未在TPC中有過研究報(bào)道，所以本研究中發(fā)現(xiàn)的microRNA-124在TPC中的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的探究。

綜上所述，microRNA-124高表達(dá)可抑制K1細(xì)胞的侵襲、遷移，其機(jī)制可能為microRNA-124下調(diào)IQGAP1表達(dá)。