流感高發季節150例流感病毒核酸陰性的流感樣病例鼻咽分泌物呼吸道病毒檢測分析

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2016年11月～2017年3月間就診于青海省人民醫院、青海省婦產兒童醫院和青海紅十字醫院等3家流感監測哨點醫院的ILI患者150例，均符合世界衛生組織(WHO)制定的ILI診斷標準(發熱超過 38 ℃，伴有咳嗽、咽痛癥狀之一，且無其他疾病診斷)，鼻咽拭子標本檢測流感病毒均為陰性。150例患者中男81例、女69例，年齡2月～122(16.50±47.25)歲，男女比例為1.17∶1，≤4歲、4～18歲、19～59歲、≥ 60歲者分別為56、22、53、19例。采集其鼻咽拭子標本，保存備用。本研究經本院倫理委員會批準同意，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 ILI患者鼻咽分泌物呼吸道病毒檢測取150例患者鼻咽拭子標本，采用西安天隆NP968自動核酸提取儀參照天隆病毒RNA/DNA提取試劑盒(ZTLJB-Y64)說明書提取病毒核酸。采用碩世生物有限公司生產的呼吸道合胞病毒A型和B型核酸檢測試劑盒(JC10216N)、腺病毒核酸檢測試劑盒(JC10117)、人鼻病毒核酸檢測試劑盒(JC10119)和冠狀病毒核酸檢測試劑盒(JC10305)檢測鼻咽拭子標本中的呼吸道病毒。呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠狀病毒的反應體系配制如下：7.5 μL核酸擴增反應液，5 μL酶混合液，4 μL病毒反應液，3.5 μL無RNA酶水，加入提取的5 μL RNA模板，配制成25 μL體系，按以下條件進行PCR擴增：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s, 45個循環。55 ℃收集熒光。腺病毒反應體系配制如下：5 μL核酸擴增反應液，0.2 μL酶混合液，4 μL腺病毒反應液，10.8 μL無RNA酶水，加入提取的5 μL RNA模板，配制成25 μL體系，按以下條件進行PCR擴增： 95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s,45個循環，55 ℃收集熒光。

2 結果

150例標本中，病毒陽性檢出率29.33%(44/150)。44例中呼吸道合胞病毒22例(14.67%)，其中A型3例(2.00%)、B型19例(12.67%)；腺病毒9例(6.00%)；鼻病毒5例(3.33%)；冠狀病毒5例(3.33%)，其中COV-229E 1例(0.67%)、COV-NL63 1例(0.67%)、COV-OC43 3例(2.00%)；混合感染 3例(2.00%)，分別為呼吸道合胞病毒B型合并COV-OC43、腺病毒和鼻病毒。病原譜構成分析顯示，呼吸道合胞病毒A型占總體陽性標本的6.81%，B型占43.18%，腺病毒占20.45%，鼻病毒占11.36%，冠狀病毒占11.36%，混合感染占6.81%。

44份病毒陽性標本中，男、女性病毒陽性檢出率分別為32.10%(26/81)、26.09%(18/69)，性別陽性率差異無統計學意義(χ2=0.650，P=0.420)。≤4歲、4～18歲、19～59歲、≥ 60歲者病毒陽性檢出率分別為41.07%(23/56)、36.37%(8/22)、16.98%(9/53)、21.05%(4/19)，不同年齡者病毒陽性檢出率間差異具有統計學意義(χ2=8.776，P=0.032)。

4歲以下兒童是呼吸道病毒的主要感染人群，病毒陽性率較高(36.37%)，19～59歲年齡者病毒陽性率最低(16.98%)。呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染多集中在4歲以下兒童。冠狀病毒平均分布在各年齡組，≥60歲者人群未檢測到鼻病毒感染。見表1。

3 討論

表1 不同年齡者病毒感染情況[例(%)]

急性呼吸道感染是一組嚴重危害人類健康的疾病，其傳染力極強，傳播速度快，發病率占急性傳染病的首位，在我國每年都有不同程度的流行。可引起急性呼吸道感染的病原十分復雜，包括細菌、病毒、支原體、衣原體和真菌等，尤其是病毒性病原體，可經飛沫傳播，具有傳染性強、潛伏期短等特點，一些病毒還可引起世界范圍的大暴發。此外，急性呼吸道感染易引起患慢性基礎性疾病的人群發生多重感染，出現重癥和死亡患者，對人類健康造成嚴重危害，對經濟及社會穩定有很大影響。因此，開展系統化、標準化的急性呼吸道感染的病原學監測和特征分析，揭示其流行規律，可為疾病的防治提供科學依據。

目前世界上的許多發達國家已經鑒定出導致ILI的常見病原體，而發展中國家關于 ILI 的流行病學及病因學研究還相對滯后[4, 5]。傳統的診斷方法包括病毒分離、免疫分析和電子顯微鏡技術等，但上述方法不僅費時費力，而且細胞培養對于某些病毒的分離比較困難(如鼻病毒、博卡病毒、人冠狀病毒等)，不利于疾病早期診斷和疫情的應急處理。因此需要靈敏度更高，特異性更強、更節省時間的檢測方法。隨著科技的進步，病毒的診斷已經進入核酸檢測的分子水平，熒光定量PCR技術已越來越多地應用于病毒的快速檢測。本研究借助流感監測網絡平臺，應用熒光定量PCR對流感病毒核酸檢測為陰性的150份流感樣病例標本進行呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和冠狀病毒等幾種常見呼吸道病毒的核酸檢測，以了解西寧市2016年11月～2017年3月流感高發季節期間這4種呼吸道病毒的感染情況。

在150例流感樣病例標本中，病毒總檢出率29.33%，高于2012～2014年遼寧省的病毒檢出率(20.66%)，低于2010～2011年北京市(39.2%)和天津市(66.4%)的病毒檢出率[6～8]。分析造成病毒陽性率差異的原因，除確實存在地區差異性，也無法排除采樣手法的不同的原因，如果無法保證每份樣本都能收集到上皮細胞，就可能造成假陰性，降低檢出率。另外，還可能是采集標本的不同，下呼吸道樣本病毒陽性率相對上呼吸道樣本要高一些。檢測結果顯示，男性病毒檢出率為32.10%，女性病毒檢出率為26.09%，性別檢出率無顯著差異。但年齡是呼吸道病毒易感性的影響因素，除冠狀病毒外，呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染人群主要集中在4歲以下嬰幼兒，可能與嬰幼兒呼吸道病原的抗體保護水平低有關。4種病毒中，呼吸道合胞病毒是西寧市此時期引起呼吸道感染比較重要的病原，感染率最高，為14.67%，高于廣州(10.63%)、西安(10.78%)、上海(7.3%)等地，低于武漢地區(22.92%)[9～12]，其中B型流感病毒感染率相對較高，占全部呼吸道合胞病毒檢出的86.36%(19/22)。本研究中，感染率位于呼吸道合胞病毒之后的為腺病毒(6.00%)，研究表明人腺病毒導致呼吸道感染檢出率為8.9%～10.5%左右，主要感染5歲以下兒童，與本研究結果基本相似[13]。鼻病毒也是ILI的常見病原體，本研究中鼻病毒檢出率為3.33%，顯著低于2006～2007年蘭州地區鼻病毒感染率(13%)[14]。研究[15]顯示冠狀病毒感染因地理位置不同差異較大，其感染率一般在0.4%～1.4%之間，也顯著低于本研究結果(3.33%)。此外，本研究中混合感染為3例，感染率為2.00%，與北京、上海地區的混合感染率2.24%和2.54%較為接近，且3例混合感染均為 RSVB聯合其他病毒，表明呼吸道合胞病毒較易發生混合感染[16, 17]。可見，ILI病原譜存在一定的地域差異，有必要對多個地區的病原譜信息進行進一步研究。

兒童因免疫功能低下，易成為急性呼吸道感染的主要高發人群，嚴重影響患兒的健康和成長發育，因此需做好相關預防措施，以減少或控制疾病，保障患兒健康成長。其中，RSVB為感染率最高的病毒，主要感染4歲以下嬰幼兒，并且是最易發生混合感染的病毒，是西寧地區嬰幼兒急性呼吸道感染的重要病原體。本研究結果提示在嬰幼兒中防控呼吸道合胞病毒感染，對降低西寧地區嬰幼兒呼吸道感染的發病率有比較重要的意義，為當地呼吸道感染防治策略的制定提供了重要參考依據。

綜上所述，ILI患者存在呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和冠狀病毒等病毒感染。≤4歲ILI者多發呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染。