腹腔注射黃芪注射液的糖尿病小鼠腎臟組織病理變化觀察

黃云芳， 付會玲，張云，劉昌璇 ，賈琳 ，黃敏 ，陳文莉

(1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢430014；2武漢市第六人民醫院)

近年來，糖尿病發病率逐年升高。糖尿病腎病(DKD)是終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。既往研究[1]發現，過度活化的腎素-血管緊張素系統(RAS)在DKD發生、發展中起重要作用。血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)具有控制血壓、減少蛋白尿、抑制炎癥反應、抗纖維化、靶器官保護等功能，是目前DKD治療的一線藥物[2, 3]。受血鉀、血肌酐，腎小球濾過率、肌酐清除率等因素限制，ACEI、ARB類藥物無法適用于各階段DKD的治療，尋找多元化DKD治療方案，是目前的DKD研究熱點。血管緊張素轉化酶是RAAS家族重要成員之一，其水平直接反應RAAS系統活躍程度。高水平血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、RAAS系統的過分活躍誘導淋巴細胞在腎臟異常聚集，產生大量炎癥因子，誘發腎臟損傷[4]。最新研究[5、6]發現，黃芪(RA)具有抗氧化應激、降糖、改善水鈉潴留、改善代謝功能紊亂等功能，可用于DKD的治療，但關于黃芪在DKD中的具體機制目前尚不明確。2016年10月～2017年11月，我們觀察了腹腔注射黃芪注射液的糖尿病小鼠腎臟組織病理變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器 7～8周齡雄性C57BL / 6J小鼠40只，體質量20～25 g(武漢大學動物實驗中心),飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心SPF級動物房。黃芪注射液(中國河北神威藥業集團有限公司)；貝那普利(常用腎臟保護藥物，北京諾華制藥公司)。鏈脲霉素(STZ)(美國Sigma公司)。

1.2 小鼠分組、糖尿病模型制備及黃芪給予方法 將C57小鼠隨機分為正常組、糖尿病組、黃芪組、貝那普利組，每組10只。正常對照組小鼠不經任何干預。黃芪組、貝那普利組、糖尿病組制作糖尿病模型(180 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ，注射后 48～72 h靜脈血糖濃度≥16.7 mmol/L且維持1周以上為造模成功)。造模成功后適應性飼養2周，黃芪組腹腔注射黃芪注射液0.03 mL/10 g,1次/d；貝那普利組予貝那普利灌胃，10 mg/kg,1次/d,糖尿病組小鼠不做任何處理。飼養12周取各組小鼠，從下腔靜脈收集小鼠靜脈血，2 000 r/min離心15 min，取上層血清，-80 ℃保存備用。向各組小鼠左心室緩慢注入預冷PBS處死各組小鼠，快速取下雙側腎臟，剝離包膜置于預冷PBS。右側腎臟1/3縱切后放入4%多聚甲醛中常溫固定，石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片。其余腎臟組織液氮冷凍后保存備用。

1.3 各組腎臟病理情況觀察 取各組腎臟組織，固定、脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、62 ℃烤片、脫蠟及水化等處理，PAS染色，染色后鏡下觀察各組腎臟病理情況。

1.4 各組小鼠腎臟組織、血清AngⅡ檢測方法 采用ELISA法。取各組腎臟勻漿及血清，腎臟勻漿5倍稀釋、血清2倍稀釋。取加樣板，每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，每組6個復孔，充分混勻置于37 ℃溫箱40 min，將反應板充分洗滌4～6次，加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL(空白孔除外)，充分混勻后37 ℃溫箱20 min，加入酶標抗體工作液100 μL，37 ℃溫箱10 min，洗滌4～6次，加入底物工作液100 μL，37 ℃溫箱避光反應15 min，加入100 μL終止液充分混勻，30 min內用酶標儀測定并記錄各組450 nm處的光密度OD值，取平均值，以OD值代表相應AngⅡ。

1.5 各組腎臟組織纖維化情況觀測 ①采用免疫組化染色法檢測各組腎臟組織α-SMA、Collagen-Ⅳ。所有操作均嚴格按照免疫組化染色試劑盒進行。②采用Masson染色法觀察各組腎臟組織纖維化情況。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 各組腎臟組織ACE、ACE2 mRNA及蛋白檢測 ①取各組腎臟組織，RIPA裂解液裂解，低溫離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，裂解液裂解后，煮沸變性混勻，10%SDS-PAGE分離，轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，5%脫脂奶粉稀釋一抗ACE(1∶200)、ACE2(1∶300)和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日拿出條帶，充分洗滌，對應二抗37 ℃搖床孵育1 h，ECL顯色，采集圖像，采用Image J 軟件分析測算各組腎臟組織ACE、ACE2蛋白的相對表達量。②采用 Real-time PCR法。取各組腎臟組織，提取RNA，用酶標儀測定提取總RNA，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其的完整性。采用TOYOBO逆轉錄試劑盒，反應體系：500 ng總RNA，1 μL Oligo dT和水，總體積12 μL，65 ℃作用5 min。加入4 μL 5 X Reaction BUffer, 1 μL RiboLock RNase Inhibitor(20 μ/μL), 2 μL 10 mmol/L dNTP Mix, 1 μL RevertAid M-Mul V Reverse Transcriptase(200 μ/μL),42 ℃作用1 h，70 ℃作用5 min，-80 ℃保存備用。引物由北京擎科生物技術有限公司合成。ACE上下游引物分別為5′-AGAGTACAACCAGATCCTGCTAGAC-3′；5′-TCCAGC-TCTTCCATGCCCATAG-3′;ACE2上下游引物分別為5′-TGTGTCTGATGTCATTCCTAGAAGTG-3′；5′-AGGC-TGGTAAGGTGGCTCAAG-3′;以GAPDH為內參，上下游引物分別為5′-ACCCCCAATGTATCCGTTGT-3′；5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′。ACE、ACE2相對表達量以2-ΔΔCt表示，實驗重復3次，取平均值。

1.7 各組腎臟組織MDA含量檢測 采用硫代巴比妥酸法。取各組腎臟組織，具體操作方法參照商業化成品試劑盒(南京建成生物工程研究所制造)說明書。在450 nm波長檢測樣本，以消除糖基化和其它類脂醛類的部分影響，所有的檢測重復3次，MDA含量為每毫克蛋白質的納摩爾數。

1.8 各組腎臟組織MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α檢測 采用 Real-time PCR法。取各組腎臟組織，檢測方法同“1.6”。MCP-1上下游引物分別為5′-CTCAGCCAGATGCAGTTAACGCCC-3′；5′-GGTGCTGAAGACCTTAGGGCAGAT-3′；TGF-β上下游引物分別為5′-GGACTCTCCACCTGCAAGAC-3′；5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTG-3′;TNF-α上下游引物分別為5′-GCCTCCCTCTCATCAGTTCT-3′；5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′;ICAM-1上下游引物分別為5′-CGGCATATTACGAGTGTGAATC-3′；5′-ATCCCGATTGGCAGGTATTA-3′;以GAPDH為內參，上下游引物分別為5′-ACCCCCAATGTATCCGTTGT-3′；5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′。每組做3個生物重復，相對表達量以2-ΔΔCt表示。

2 結果

2.1 各組腎臟組織病理變化 與正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠腎臟組織腎小球肥大、系膜基質增多和系膜細胞增生的病理改變，黃芪組小鼠腎臟組織和貝那普利組小鼠腎臟組織腎小球肥大、系膜基質增多和系膜細胞增生情況減輕。

2.2 各組腎臟組織、血清AngⅡ相對表達量比較 各組腎臟組織、血清AngⅡ相對表達量比較見表1。

表1 各組腎臟組織及血清AngⅡ相對表達量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

2.3 各組腎臟組織纖維化情況比較 各組腎臟組織α-SMA、Collagen-Ⅳ相對表達量比較見表2。糖尿病組小鼠腎臟間質膠原沉積較正常對照組小鼠明顯增加,黃芪組、貝那普利組腎臟組織膠原沉積量減少。

表2 各組腎臟組織α-SMA、Collagen-Ⅳ相對表達量比較

注： 與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05；與貝納普利組比較，※P<0.05。

2.4 各組腎臟組織ACE、ACE2 mRNA及蛋白相對表達量比較 見表3。

表3 各組腎臟組織ACE、ACE2 mRNA及蛋白相對表達量比較

注： 與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

2.5 各組腎臟組織MDA含量比較 黃芪組、貝那普利組、糖尿病組、正常對照組腎臟組織MDA含量分別為(41.28±4.02)、(36.46±1.97)、(54.74±2.61)、(36.01±2.91)ng/mL,與正常對照組比較，糖尿病組、黃芪組、貝那普利組腎臟組織MDA含量均升高(P均<0.05)；與糖尿病組比較，貝那普利組腎臟組織MDA含量均降低(P均<0.05)。

2.6 各組腎臟組織MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α mRNA相對表達量比較 見表5。

表5 各組腎臟組織MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α mRNA相對表達量比較

注： 與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

3 討論

RAS系統過度活化是促進糖尿病腎病發生及進展的關鍵機制，尤其是腎臟組織局部的RAS。AngⅡ是最重要的效應分子，AngⅡ與AT1受體結合后可通過多種分子信號機制收縮血管、使反應性活性氧簇(ROS)物質增多,并通過ROS依賴性機制和非ROS依賴性機制造成血管損傷、炎癥反應、細胞增殖等[7]，刺激Ⅰ型膠原蛋白及TGF-β合成、進而導致成纖維細胞的分化[8]，最終引起腎臟纖維化及硬化。本研究發現，糖尿病小鼠腎臟組織中AngⅡ濃度明顯升高；黃芪和貝那普利均可降低小鼠腎臟中AngⅡ含量,且黃芪和貝那普利組小鼠腎臟中AngⅡ表達差異無統計學意義；而各組血液中AngⅡ濃度均無明顯差異。糖尿病小鼠血液中AngⅡ濃度并無增高，僅在腎臟組織局部增加。糖尿病患者血中RAS成分與正常人相似，有時可能更不活躍，推測可能與糖尿病狀態下細胞外液過多抑制其活性有關[9]。有研究[10]發現黃芪甲苷可以降低兩腎一夾型高血壓大鼠腎臟組織AngⅡ的水平，減輕腎臟病理損傷，與本實驗相符。

糖尿病腎病的病理改變表現為系膜基質增多、腎小球基底膜增厚、系膜細胞數目增加，Collagen-Ⅳ是 ECM 重要成分，其合成和降解代謝失調可導致腎小球及間質硬化及纖維化，α-平滑肌肌動蛋白，是間質纖維化的一個標志物。本研究結果顯示，糖尿病組腎臟組織α-SMA、Collagen-Ⅳ相對表達量明顯上升，腎臟間質膠原沉積較正常對照組小鼠明顯增加，黃芪干預后，上述指標的含量分別顯著減少，而黃芪組小鼠和貝那普利組小鼠上述指標的表達量差異無統計學意義；提示黃芪可以遏制DM小鼠腎臟的纖維化。

RAS系統在炎癥和纖維化中起關鍵作用。實驗表明ACEI類藥物貝那普利經阻斷腎內 RAS 可以緩解TGF-β介導 ECM 積聚引起的腎小球硬化 ,從而延緩腎功能惡化[11]。對糖尿病大鼠的實驗研究顯示，黃芪可以降低腎臟皮質TGF-β水平，從而減少Ⅳ型膠原的沉積，抑制ECM沉積[12]。

ACE2是對腎臟保護的有益因子，但本研究結果提示，糖尿病組小鼠腎臟ACE2的表達量較非糖尿病組小鼠明顯增加,經黃芪干預后，糖尿病小鼠ACE2的表達量反而明顯降低，且黃芪組小鼠和貝那普利組小鼠在ACE2表達量方面未見明顯差異；而各組小鼠在ACE表達上卻呈現相反趨勢，即：DM組小鼠的ACE表達量較非糖尿病組小鼠明顯減少，經黃芪干預后，上述指標的表達量明顯提高，黃芪組和貝那普利組小鼠在ACE表達量上無明顯統計學差異。譚宇等[13]給予人腎小管上皮細胞不同濃度的 Ang Ⅱ 刺激并觀察ACE 及 ACE2 表達的變化，結果發現Ang Ⅱ可通過ROS上調腎小管上皮細胞內ACE的表達，下調ACE2表達。國外學者[14]在神經細胞中也發現Ang Ⅱ上調ACE表達，下調ACE2表達，遺憾的是，以上研究均為體外實驗，且均為高濃度的Ang Ⅱ刺激。

推測本實驗結果原因可能為，糖尿病早期ACE2反應性表達增多加強降解Ang Ⅱ發揮積極的保護作用。本實驗所測為包含腎小球及腎小管的總的ACE及ACE2，并未區分腎小球區及腎小管區，腎小球及腎小管之間的分布有否差異尚不清楚。本實驗僅觀察了12周腎臟組織的變化，是否是糖尿病腎病早期的一種代償機制尚需進一步觀察。

MDA是自由基作用于脂質產生過氧化反應的終產物，使蛋白質、核酸等生物大分子交聯結合，具有細胞毒性，其含量可提示體內脂質過氧化的速度和強度，丙二醛參與糖尿病腎病的發生與發展[15]。本研究結果顯示，糖尿病組小鼠腎臟MDA含量較非糖尿病組小鼠明顯增加，經黃芪干預后，MDA含量明顯降低，且黃芪組小鼠和貝那普利組小鼠MDA含量未見明顯差異。結果表明黃芪可阻遏脂質過氧化反應，與趙蓮芳等[16]研究結果一致。

長期葡萄糖代謝異常導致蛋白激酶C(PKC)活性增加，多元醇通路激活，使促纖維化因子(TGF-β和結締組織生長因子)等分泌顯著增加，而TNF-α、TGF-β等各種炎性因子的釋放增加，促進膠原蛋白Ⅳ及纖維連接蛋白合成增多，導致腎小球系膜細胞增生，加速腎小球纖維化[17]。ICAM-1即細胞間黏附分子，是介導黏附反應的單鏈跨膜糖蛋白，其受體為整合素家族的黏附分子-白細胞功能相關抗原-1(LFA-1)，已發現細胞間黏附分子/白細胞功能相關抗原-1的相互作用在淋巴與內皮細胞的結合及淋巴細胞介導的細胞毒反應過程中具有非常重要的作用，促進腎小球處白細胞的黏附加速，進而導致腎小球的損傷[18]。本實驗結果顯示，糖尿病組小鼠的MCP-1、TGF-β和TNF-α的表達量增加；黃芪組MCP-1、 TGF-β和TNF-α表達量降低。

綜上所述，腹腔注射黃芪注射液的糖尿病小鼠腎臟組織病理改變減輕，其機制可能為黃芪抑制腎素-血管緊張素系統、TGF-β導致的組織纖維化、氧化應激炎癥反應。