干擾MiRNA-155表達的尋常型銀屑病患者CD4+T細胞分化觀察

蘇華振,魏明

(鄭州大學第五附屬醫院，鄭州450052)

銀屑病是一種多基因遺傳背景下由T淋巴細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，CD4+T細胞及多種細胞因子在銀屑病的發生、發展中起著重要作用[1]。尋常型銀屑病是常見的銀屑病類型，近年發病率逐年升高。尋常型銀屑病的發病機制十分復雜，遺傳、免疫、感染、內分泌等因素均參與了其發病過程。T helper cell 17(Th17)細胞是一種以分泌白介素(IL)-17為主的CD4陽性T淋巴細胞(CD4+T)細胞亞群。研究[2,3]表明，Th17細胞及相關細胞因子參與了尋常型銀屑病的發病過程。微小核糖核酸(miRNA)-155是機體正常免疫調節所必需的miRNA分子，可通過不完全堿基互補方式與miRNA相應的區域結合，抑制蛋白質翻譯。E26轉錄因子(Ets)-1是miRNA-155的靶基因[4]，能夠調控Th17細胞在內的多種細胞的增殖和分化，參與自身免疫性疾病的發生與發展[5,6]。研究[6]表明，Ets-1缺陷鼠的Th細胞比野生型鼠的Th細胞向Th17細胞分化增多，說明Ets-1是Th17細胞分化的負性調節因子，Ets-l缺陷會導致Th17細胞相關應答的異常。目前關于miRNA-155在尋常型銀屑病外周血CD4+T中的表達對Th17細胞的分化的影響及其調控機制尚不清楚。2016年4月～2017年8月，我們觀察了抑制miRNA-155對尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞分化的影響，并探討其可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年4月～2017年8月間就診于我院皮膚性病科門診的尋常型銀屑病患者30例，其中男20例、女10例，年齡32.6歲，病程1個月～20年，平均6.8年。均符合《中國臨床皮膚病學》[7]的尋常型銀屑病診斷標準。排除標準：近2周內局部外用皮質類固醇激素及免疫抑制劑；近1個月系統應用糖皮質激素、阿維A、補骨脂素等系統治療、紫外線治療及日光浴；有心臟、肝腎疾病及精神疾病者；有感染、妊娠、分娩、外傷等應激狀態；存在各器官惡性腫瘤者。另選擇30例健康志愿者為正常對照組，其中男19例、女11例，年齡32.4歲。兩組年齡、性別比例等臨床資料具有可比性。本研究獲醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及儀器 改良型RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)；淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)；TRIzol-A+總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)；脂質體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；藻紅蛋白-青色素染料5(PE-Cy5)標記小鼠抗人CD4單克隆抗體、FITC標記小鼠抗人IL-17A單克隆抗體(美國Biolegend公司)；佛波酯、離子霉素、莫能霉素(美國Sigma公司)；破膜劑(美國BD公司)；人CD4+T細胞分選試劑盒(挪威Dynal公司)；β-肌動蛋白(actin)多克隆抗體(美國Proteintech Group公司)；IL-17酶聯免疫吸附試驗(enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA)定量檢測試劑盒(美國R&D公司)；實時定量PCR試劑盒(美國GeneCopeia公司)；Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司)；垂直電泳儀、蛋白電泳轉膜裝置、GelDoc 2000型凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3 標本采集 抽取兩組空腹外周靜脈血10 mL，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，采用免疫磁珠法從單個核細胞中分選CD4+T細胞，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。流式細胞術檢測細胞的純度。

1.4 外周血miRNA-155、表達IL-17A細胞比例及IL-17檢測 取兩組分選的CD4+T細胞，加入10 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-23、20 μg/L IL-6刺激培養72 h，誘導Th17分化。①采用qPCR法檢測外周血miRNA-155 取轉染48 h后各組細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，取0.5 μg總RNA，逆轉錄合成cDNA后擴增。miRNA-155正向引物序列：5′-GCCGTTAATGCTAATCGTGAT-3′，反向引物序列：5′-TGGGTTCATTTTCTGGGTCTT-3′；以U6作為內參，正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR體系為25 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸60 s，共40個循環。采用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測各樣本的域值循環數 (CT值)，以2-△△CT代表目的基因的相對表達量。②采用流式細胞儀測算表達IL-17A細胞比例取對數生長期各組細胞，培養24 h，取1×106個細胞懸浮液加入2 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min(離心半徑13.5 cm)，棄上清；加入1 mL冷PBS洗滌，離心后棄上清；加入用PBS稀釋的CD4+FITC抗體100 μL和IL-17A熒光標記的抗體，空白對照管中加入對應的IgG，的PBS，吹打混勻，置于流式管中，采用流式細胞儀測算各組IL-17A細胞所占比例。③采用酶聯免疫吸附試驗檢測外周血Th17，所有操作遵照鄭州大學醫學倫理委員會人體試驗管理規范執行。實驗均重復3次，取平均值。

1.5 抑制miRNA-155對尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞分化的影響

1.5.1 細胞分組及miRNA-155轉染方法 取“1.3”中分離培養的尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞。加入10 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-23、20 μg/L IL-6刺激培養72 h，誘導Th17分化；將誘導分化的細胞2×106/孔接種于6孔板中，細胞鋪板在2 mL含血清、不含抗生素的培養基,細胞融合60%～70%時，將細胞分為miRNA-155模擬物組、miRNA-155抑制物組、空白對照組。miRNA-155模擬物組、miRNA-155抑制物組、空白對照組分別加入含Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基+50 nmol/LmiRNA-155模擬物、含Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基+50 nmol/LmiRNA-155抑制物、含有Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基，各組轉染體系為500 μL。孵育6 h，改用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI 1640培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，取少量細胞懸液，涂布于載玻片，倒置相差螢光顯微鏡下調至藍色激發螢光，觀察各組細胞轉染情況，轉染成功細胞發出綠光。計算各組轉染率。可見光下固定1個視野計數，計數總細胞數，然后轉換螢光光源，計數發出綠色螢光的細胞。轉染率=發出綠色螢光細胞數/總細胞數×100%。

1.5.2 CD4+T細胞表達IL-17A細胞比例、培養液IL-17檢測方法 采用流式細胞儀。取對數生長期各組細胞，采用流式細胞儀測算各組IL-17A細胞所占比例。取對數生長期各組細胞，采用酶聯免疫吸附試驗檢測IL-17A。實驗重復3次，取平均值。

1.5.3 細胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA檢測 采用qPCR法。取轉染48 h后各組細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，取0.5 μg總RNA，逆轉錄合成cDNA后擴增。miRNA-155模擬物正向引物序列、反向引物序列同“1.4”，miRNA-155抑制物正向引物序列5′-GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，反向引物序列： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；以U6作為內參。IL-17A正向引物序列：5′-CGGCTGGAGAAGATACTGGT-3′，反向引物序列：5′-TTAGTCCGAAATGAGGCTGTC-3′。Ets-1正向引物序列：5′-TCTGGATAG-GCTGGGTTGA-3′，反向引物序列：5′-CGCCCTGGGTAAAGACTGC-3′。IL-17A、Ets-1以β-actin為內參，β-actin正向引物序列：5′-GGCTACAGCTTCACCACCAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGCTCAGGAGGAGC-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR體系為25 μL。反應條件同“1.4”，以2-△△CT代表目的基因的相對表達量。每個樣本均測3次，取平均值。

1.6 Ets-1基因siRNA與miRNA-155共同作用對CD4+T細胞分化的影響

1.6.1 細胞分組及Ets-1基因siRNA、miRNA-155轉染方法 取“1.3”中分離培養的尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞，加入IL-2刺激培養72 h，將細胞分為A、B、C組。A、B、C組分別加入含Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基+50 nmol/LmiRNA-155模擬物、含Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基+50 nmol/LmiRNA-155抑制物、含有Lipofectamine2000的DMEM高糖培養基。A、B、C組再各自分為兩個亞組，分別轉染Ets-1siRNA、Ets-1siRNA陰性對照(分為A1、A2、B1、B2、C1、C2)，培養48 h。

1.6.2 各組細胞IL-17A和Ets-1mRNA檢測方法 采用熒光定量RT-PCR法檢測IL-17A和Ets-1mRNA。Ets-1基因siRNA序列正向引物：5′-GCAGAAAGAGGAUGUGAAAUU-3′，反向引物：5′-UUUCACAUCCUCUUUCUGCUU-3′，siRNA干擾序列由上海吉瑪生物公司合成。IL-17A、Ets-1以β-actin為內參，反應條件同“1.4”，以2-△△CT代表目的基因的相對表達量。每個樣本均測3次，取平均值。

1.6.3 各組細胞Ets-1蛋白檢測方法 收集各組細胞，蛋白裂解液提取細胞總蛋白，冰浴中充分勻漿，冰上靜置30 min。14 000 r/min，4 ℃離心20 min(離心半徑10 cm)，取上清蛋白液。Bradford法測定蛋白濃度。取蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道上樣60 μg變性蛋白，待目的蛋白及內參分離后半干轉(0.1 A，35 min)將蛋白轉至孔徑為0.45 μm的聚偏氟乙烯膜。5%脫脂牛奶(1×TBST稀釋)室溫搖床封閉1 h，隨后加入Ets-1兔抗人一抗(1∶1 000，1 × TBST稀釋)，4 ℃搖床過夜。室溫搖床復溫30 min，辣根過氧化物酶標記的兔二抗IgG(1∶1 000，1×TBST稀釋)室溫搖床孵育1 h，ECL化學發光顯色。內參選用β-actin，采用Gel-Doc2000軟件對圖片進行灰度分析，將目的條帶與內參的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。每個樣本重復實驗3次，取平均值。

2 結果

2.1 尋常型銀屑病、健康體檢者外周血miRNA-155、IL-17A細胞比例及IL-17相對表達量比較 尋常型銀屑病、健康體檢者外周血miRNA-155相對表達量分別為5.69±1.24、1.78±0.42，二者比較，P<0.05。常型銀屑病、健康體檢者外周血IL-17A細胞15.89%±2.63%、4.72%±2.57%，二者比較，P<0.05。常型銀屑病、健康體檢者外周血IL-17水平分別為(28.67±3.85)、(7.41±2.34)ng/mL，二者比較，P<0.05。

2.2 各組CD4+T細胞表達IL-17A細胞比例、IL-17水平比較 模擬物組、抑制物組、空白對照組CD4+T細胞表達IL-17A細胞比例分別為34.56%±4.78%、19.21%±1.56%、21.23%±2.65%，組間兩兩比較，P均<0.05。模擬物組、抑制物組、空白對照組培養液IL-17水平分別為(1 486±137)、(783±86)、(886±100)pg/mL，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 各組細胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA相對表達量比較 見表1。

表1 各組細胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組、抑制物組比較，#P<0.05。

2.4 各組細胞IL-17A、Ets-1mRNA相對表達量比較 見表2。

表2 各組細胞IL-17A、Ets-1mRNA相對表達量比較

注：與本組比較，#P<0.05；與B組比較，＊P<0.05。

2.5 各組細胞Ets-1蛋白相對表達量比較 A組Ets-1siRNA、Ets-1siRNA陰性對照者的Ets-1蛋白相對表達量分別為0.21±0.11、0.31±0.13，B組Ets-1siRNA、Ets-1siRNA陰性對照者的Ets-1蛋白相對表達量分別為0.33±0.12、0.56±0.27，C組Ets-1 siRNA、Ets-1 siRNA陰性對照者的Ets-1蛋白相對表達量分別為0.31±0.10、0.65±0.22，與本組Ets-siRNA陰性對照者比較，Ets-siRNA者Ets-1蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。

3 討論

Th17細胞通過分泌IL-17等細胞因子發揮促炎作用，連接天然免疫和適應性免疫，還能刺激角質形成細胞分泌 TNF-α和表皮增殖[8]。也有研究[9]發現miRNA-155不僅控制CD4+T細胞分化，還調控正常B細胞的分化，表明miRNA-155可能是免疫系統的重要調控者。miRNA在免疫系統中執行精細的調節作用，例如在巨噬細胞中，靶基因是IL-13Rα[10]；在CD4+T細胞各亞群中，調節性T細胞中的靶基因是SOCS1[11]，而向Th1亞群分化時靶基因為IFN-γRα，而不是SOCS1[12]；miRNA-155還可以通過抑制Shipl基因的表達而調控IFN-γ的水平[13]。

O′Connell等[9]證實miRNA-155(-/-)小鼠能有效抵抗實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發生，因為miRNA-155能促進Th17和Th1細胞亞群的發育。另有動物試驗[14]證實miRNA-155(-/-)小鼠不會發展成膠原誘導性關節炎，miRNA-155缺陷可以阻止自身反應性B細胞和T細胞的產生。miRNA-155(-/-)小鼠不僅局部淋巴結的Th17相關細胞因子IL-17水平顯著下降，而且血清中的IL-17和IL-6均比野生小鼠降低，表明miRNA-155缺陷可使Th17細胞分化受阻，提示miRNA-155在Th17細胞發育并分泌相關細胞因子過程中起著關鍵性的作用。

本研究結果顯示miRNA-155模擬物組Th17細胞表達和IL-17A水平明顯高于空白對照組和miRNA-155抑制物組，提示miRNA-155能夠促進Th17細胞分化；進一步檢測miRNA-155、IL-17A和Ets-1的mRNA，結果顯示miRNA-155模擬物組miRNA-155、IL-17A mRNA表達顯著升高，Ets-1mRNA表達明顯降低，提示miRNA-155可能通過抑制Ets-1來促進IL-17的表達。Du等[15]報道miRNA-326通過調控其靶基因Ets-1促進IL-17表達參與多發性硬化癥的發病，證實Ets-1是Th17亞群分化產生IL-17的重要負性調控因子。Romania等[4]利用生物信息學分析以及實驗均證實Ets-1也是miRNA-155的靶基因。Yao等[16]還證實miRNA-155通過其靶基因SOCS1調控Th17細胞的分化和Th17細胞的功能。表明miRNA-155在免疫系統中的調控作用是錯綜復雜的，提示在不同的免疫細胞或者向不同亞群分化過程中，miRNA-155是通過不同的特異性靶基因來調控。

綜上所述，尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞miRNA-155水平升高、Ets-1水平降低。抑制miRNA-155表達可抑制CD4+T細胞分化為Th17細胞，其機制可能為抑制Ets-1mRNA及蛋白表達。本研究僅限于體外對純化的CD4+T細胞進行研究，需進一步利用動物模型來闡明miRNA-155在銀屑病中的作用機制。