抑制miR-182表達對人乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響及其機制

董超，黃遠麗，徐正豐

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院，湖北荊州434020)

乳腺癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤。我國乳腺癌發病率逐年升高，且具有年輕化趨勢，已成為我國女性腫瘤性死亡的最常見原因[1]。近年基因變異導致相關功能因子表達紊亂在乳腺癌的發生、發展中作用相關研究是目前腫瘤研究熱點[2]微小RNA(miRNA)表達失衡在乳腺癌中作用的研究越來越受到關注[3,4]。miR-182是miRNA家族重要成員之一，其定位于人7號染色體(7q32.2)，與miR-96、miR-183形成一個基因簇。miR-182表達異常與結直腸癌[5]、原發性肉瘤[6]、肺癌[7]等許多惡性腫瘤的發生發展密切相關。但目前有關miR-182在乳腺癌中表達情況的研究甚少，并且作用機制尚不明確。Forkhead轉錄因子(FOXO1)是miR-182的下游調控靶基因，在惡性腫瘤[8,9]、阿爾茨海默病、帕金森疾病[10]、成骨細胞分化[11]等多種生理、病理過程中發揮重要作用。2017年10月～2018年3月，我們觀察了抑制miR-182對人乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響，并探討其可能作用機制。本研究通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-182在人乳腺癌組織和細胞中表達情況，觀察其對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并進一步探討可能的下游調控機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2015年1月華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院手術切除的乳腺癌組織標本89例及距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁組織標本，組織離體30 min內液氮速凍，-80 ℃保存備用。89例均為女性患者，術前均未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療。患者均對本研究知情同意，本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞、試劑及儀器 人乳腺癌細胞SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮細胞HBL-100均購自美國ATCC，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。miR-182 inhibitor(可抑制miR-182表達)和inhibitor-NC購自上海吉瑪制藥公司。

1.3 癌組織、癌旁組織miR-182檢測方法 采用時熒光定量PCR(qRT-PCR)法。取癌組織、癌旁組織標本。采用TRIzol Reagent提取組織總RNA，RNA的純度和濃度用核酸定量儀檢測，吸光度OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.0表示RNA純度合格。取100 ng總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟制備cDNA保存備用。取cDNA和引物，配置PCR反應體系，反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。miR-182 引物序列：上游引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′,下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以2-△△Ct表示miR-182的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100細胞miR-182檢測方法 取對數生長期SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和HBL-100， 采用qRT-PCR法檢測細胞miR-182，操作方法同“1.2”。實驗重復3次，取平均值。

1.5 抑制miR-182對MDA-MB-231細胞遷移、侵襲的影響

1.5.1 細胞分組及miR-182 inhibitor轉染方法 取對數生長期MDA-MB-231細胞接種于6孔板，分為觀察組、對照組，每組6個復孔。細胞密度達80%時觀察組和對照組采用LipofectamineTM2000分別轉染miR-182 inhibitor、inhibitor-NC，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。qRT-PCR檢測轉染效率結果顯示，觀察組、對照組細胞miR-182相對表達量分別為0.18±0.09、1.01±0.04(P<0.01)，證明轉染效成功。

1.5.2 細胞侵襲情況觀察 采用Transwell侵襲實驗。基質膠包被Transwell小室底膜上室面，收集轉染24 h兩組細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，饑餓處理24 h，取250 μL加入小室上室，下室加入500 μL含10% 胎牛血清的DMEM培養基,培養箱培養24 h后取出小室，PBS洗滌2遍，棉簽輕柔擦去上室面殘余細胞，4%多聚甲醛固定,染色。倒置顯微鏡觀察小室下室細胞數目。以侵襲細胞數代表細胞侵襲情況。實驗重復3次，取平均值。

1.5.3 細胞遷移情況觀察 采用Transwell實驗。Transwell小室底膜的上室面不給予基質膠包被，余操作步驟同“1.3.2”。

1.5.4 兩組細胞FOXO1 mRNA和蛋白檢測方法 采用qRT-PCR法檢測細胞FOXO1 mRNA。采用Western blotting法檢測細胞FOXO1 蛋白。取轉染24 h兩組細胞，抽提細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每個樣本取50 μg總蛋白上樣，10% SDS-PAGE分離，采用濕轉法電轉移至硝酸纖維素膜，5 %脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗FOXO1、GAPDH和二抗，孵育后ECL顯影液顯影，以Quality One軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織miR-182相對表達量比較 癌組織、癌旁組織miR-182相對表達量分別為6.60±0.53、1.02±0.05，二者比較，P<0.05。miR-182表達與乳腺癌患者TNM分期及淋巴結轉移有關(P均<0.01)，而與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、ER狀態、C-erbB-2狀態、PR狀態無關(P均>0.05)。見表1。

2.2 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100細胞miR-182相對表達量比較 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100細胞miR-182相對表達量分別為5.46±0.20、4.50±0.47、6.63±0.71、1.03±0.04，與HBL-100相比，SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231細胞miR-182相對表達量升高(P均<0.01)。

2.3 兩組侵襲細胞數、遷移細胞數比較 觀察組、對照組侵襲細胞數分別為(53±10)、(118±19)個，二者比較，P<0.05；觀察組、對照組遷移細胞數分別為(78±9)、(181±17)個，二者比較，P<0.05。

表1 miR-182表達與乳腺癌臨床病理參數的關系(例)

2.4 兩組細胞FOXO1 mRNA和蛋白相對表達量比較 觀察組、對照組FOXO1 mRNA相對表達量分別為11.16±0.79、1.06±0.06，二者比較，P<0.05；觀察組、對照組FOXO1蛋白相對表達量分別為1.19±0.17、0.35±0.11，二者比較，P<0.05。

3 討論

腫瘤轉移是乳腺癌患者死亡的首要原因，發生轉移的乳腺癌患者預后差，生存期短。轉移的乳腺癌細胞常伴隨著對傳統治療藥物的耐藥性，現有腫瘤治療藥物對于組織學形態多樣、高度異質性的乳腺癌仍顯不足。

miRNA是近年來發現的一類長度較短的單鏈非編碼RNA，與靶基因的3′非翻譯區互補結合，誘導靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，從而實現對靶基因表達的調控作用[12]，在機體細胞增殖、凋亡、分化、代謝等過程中發揮著重要的作用。miRNA作為一類新的癌基因或者抑癌基因，其表達失衡在惡性腫瘤的發生發展中起著重要的作用，通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等腫瘤生物學特性影響惡性腫瘤的發生及進展[13]。miR-182由Lagos-Quintana等[14]由2003年研究小鼠眼睛中miRNAs表達情況時發現，miR-182與視力的發育及相關疾病相關[15]。近年研究顯示，miR-182在結直腸癌[5]、原發性肉瘤[6]、宮頸癌[8]、前列腺癌[9]、肝細胞癌[16]等多數惡性腫瘤中表達增高，起癌基因作用。但在肺癌[7]、膠質瘤[17]等少數惡性腫瘤中表達降低，起抑癌基因作用。因此miR-182在惡性腫瘤發生、發展中的作用機制復雜，其具體的作用機制尚不明確。本研究發現，乳腺癌組織miR-182相對表達量高于相對應癌旁組織，SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231細胞miR-182相對表達量高于HBL-100，提示miR-182可能作為著癌基因參與乳腺癌的發生。miR-182的表達與乳腺癌TNM分期及淋巴結轉移有關，與年齡、腫瘤直徑、組織學分級、ER狀態、C-erbB-2狀態、PR狀態等臨床病理特征無關。在不同的腫瘤臨床分期及淋巴結轉移組間miR-182表達水平有顯著差異，Ⅲ+IV期乳腺癌組織中miR-182的表達水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴結轉移乳腺癌組織中miR-182的表達水平明顯高于無淋巴結轉移者，提示乳腺癌組織中miR-182的表達與乳腺癌的臨床進展有關。

增殖、侵襲及遷移等是惡性腫瘤細胞最基本的腫瘤生物學行為，研究已經證實抑制多種腫瘤細胞中miR-182的表達升高可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等細胞生物學行為[5，6，8，9，17]。本研究發現，抑制細胞miR-182表達能夠明顯抑制MDA-MB-231的侵襲和遷移能力。FOXO1是FOX蛋白家族的一個重要成員，可作為一種腫瘤抑制因子參與惡性腫瘤的發生進展。FOXO1在乳腺癌組織和細胞中表達均降低[18]，上調乳腺癌組織中FOXO1的表達能夠抑制瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[19]，起著抑癌基因的作用。近期Tang等[8]在研究中發現miR-182通過下調FOXO1表達在宮頸癌中發揮癌基因的作用。Wallis 等[9]報道在前列腺癌中miR-182通過抑制FOXO1的表達促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究發現，下調miR-182能夠明顯上調MDA-MB-231細胞FOXO1 mRNA和蛋白相對表達量，提示miR-182在乳腺癌中可能也可以通過調控FOXO1基因的表達來發揮作用。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-182高表達。抑制miR-182表達可抑制MDA-MB-231細胞的侵襲、遷移，其機制可能為上調FOXO1的表達。