血漿甲基化透明質酸酶-2檢測對胰腺癌的診斷效能

郝一,張煦,李紅超 ,鮑美華

(1 長沙醫學院基礎醫學院，長沙410219； 2蘭州大學基礎醫學院；3湖南省腫瘤醫院；4長沙醫學院)

胰腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，患者中位生存期3～6個月，五年生存率不足5%[1]。病理組織活檢是目前臨床胰腺癌的診斷金標準，其他輔助診斷方式包括以糖類抗原CA19-9為主的血漿腫瘤標志物、影像學檢查以及內鏡等方法。癌胚抗原(CEA)是臨床常用的腫瘤相關抗原。CA19-9是應用最廣泛和臨床價值最高的胰腺癌腫瘤標志物，但其在胃腸道腫瘤、急慢性胰腺炎及肝硬化等非胰腺惡性腫瘤疾病中均能出現[2]。CT檢查是疑似胰腺腫瘤的首選影像學檢查，但胰腺癌早期缺乏特異性的影像學表現，影像學檢查在胰腺癌的早期診斷敏感性和特異性均不理想[3]。胰腺癌患者早期常缺乏明顯臨床癥狀，確診時只有15%～20%的患者可行手術治[4]。晏冬等[5]關研究發現，DNA甲基化對胰腺癌的診斷尤其是其早期診斷，具有重要價值。透明質酸酶-2(HYAL2)是一種抑癌因子，可降解透明質酸，參與細胞黏附、 細胞運動、細胞遷移、血管生成和新陳代謝等過程。目前關于甲基化HYAL2水平在胰腺癌診斷中的應用情況相關報道較少。本研究觀察了64例胰腺癌患者外周血甲基化HYAL2水平，探討外周血甲基化HYAL2水平對胰腺癌的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年12月間我院收治的疑似胰腺癌患者125例，其中男66例、女59例，年齡41～65(52.42±11.35)歲。排除標準：①既往胰腺癌相關放化療者；②合并其他部位原發性惡性腫瘤者；③合并嚴重的心、肝、肺等其他臟器病變者。125例患者均行手術切除胰腺組織并行病理學檢查。經組織病理學檢查分為胰腺癌組64例(觀察組)，其中男34例、女30例，年齡42～64(51.89±11.62)歲；均為胰腺導管腺癌，根據UICC第六版胰腺癌TNM分期Ⅰ期26例、Ⅱ期38例，血紅蛋白含量(Hb)(11.23±3.21)g/dL，白細胞計數(WBC)(8.01±5.34)×103/L，血小板計數(PLT)(105.32±70.12)×103/L，尿素(BUN)(4.72±3.34)mmol/L，堿性磷酸酶(ALP)(80.79±21.64)U/L，血漿淀粉酶(AMS)(190.52±171.12)U/L，脂肪酶(LPS)(341.56±83.61)U/L，總膽紅素(TBil)(20.32±1.29)μmol/L，直接膽紅素(DBil)(7.42±1.96)μmol/L。觀察組術后病理可見實性腫物，邊界不清，質硬，灰白或灰黃色，彌漫浸潤胰腺實質，受累的導管或小導管常擴張。部分組織出現實性癌巢，腺管不規則，癌細胞核極向消失，可見細胞異型性。胰腺良性疾病患者61例(對照組)，其中男32例、女29例，年齡40～66(53.12±13.85)歲；其中慢性胰腺炎38例、胰腺囊腫15例、胰腺假性囊腫8例，Hb(12.16±2.08)g/dL，WBC(9.27±5.47)×103/L，PLT(107.32±73.23)×103/L，BUN(4.43±3.11)mmol/L，ALP(83.32±24.01)U/L，AMS(658.12±67.43)U/L，LPS(632.34±52.98)U/L，TBil(16.54±1.39)μmol/L，DBil(6.56±1.78)μmol/L。慢性胰腺炎患者術后病理可見腺泡組織呈不同程度萎縮，間質彌漫性纖維組織增生和淋巴細胞、漿細胞浸潤，導管輕度擴張。兩組年齡、Hb、WBC、PLT、BUN、ALP、TBil、DBil等指標間差異無統計意義。對照組血漿AMS、LPS水平高于觀察組(P均<0.05)。所有患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲倫理委員會批準。

1.2 血漿甲基化HYAL2檢測方法 取兩組空腹靜脈血，2 500 r/min離心，分離血漿，-30 ℃保存備用。引物及探針由上海生工生物工程有限公司輔助設計及合成；2×TAG PCR MIX為北京歐比特有限公司產品；實時熒光定量PCR儀器為Life Technologies公司產品。

應用DNA提取試劑盒提取血漿DNA并用Alpha-1900紫外分光光度儀測定DNA濃度及純度；取1 μg提純DNA按照操作說明書進行進行亞硫酸氫鹽化修飾；2 μL修飾后DNA進行MSP；Meth Premier5.0軟件設計甲基化特異引物、非甲基化特異引物序列見表1；PCR反應總體系為25 μL，PCR buffer 2.5 μL， 2 μL dNTP mixture 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Tap酶0.125 μL，修飾后DNA模板4 μL。 PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；取5 μL部分擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，另取5 μL擴增產物送威斯騰生物有限公司用MethyLight定量PCR方法進行甲基化HYAL2水平定量檢測,使用甲基化百分比參數(PMR)來描述甲基化HYAL2。

表1 HYAL-2甲基化/非甲基化特異引物序列

2 結果

觀察組、對照組分別有2、13例擴增出甲基化HYAL2陽性片段，片段長度111 bp。觀察組、對照組甲基化HYAL2檢出率分別為20.3% (13/64)、3.3%(2/61)，二者比較，P<0.05。觀察組、對照組血漿甲基化HYAL2的PMR分別為26.12%±10.11%、46.54%±18.86%，二者比較，P<0.05。

觀察組、對照組血漿CEA分別為(23.02±11.96)、(13.17±7.84)ng/mL，二者比較，P<0.05；觀察組、對照組血漿CA19-9分別為(215.39±38.05)、(26.40±20.31)U/mL二者比較，P<0.05。多因素Logistic回歸分析結果顯示，血漿CA19-9、CEA及甲基化HYAL2是胰腺癌的影響因素。見表2。

相關性分析結果顯示，胰腺癌患者血漿甲基化HYAL2水平與血漿CEA、CA19-9均呈負相關(r=-0.755，-0.512；P均<0.05)。

表2 血漿AMS、LPS、CA19-9、CEA及甲基化HYAL2水平對胰腺癌診斷的多因素回歸分析結果

血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.804，最佳診斷點34.435%，其敏感度為73.8%，特異度為85.3%；血漿CEA診斷胰腺癌的AUC為0.597，最佳診斷點為16.97 ng/mL，其敏感度為51.6%，特異性為68.9%；血漿CA19-9診斷胰腺癌的AUC為0.775，最佳診斷點為162.49 U/mL，其敏感度為75.0%，特異性為79.2%；因血漿CA19-9的AUC高于血漿CEA，故做血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯合診斷胰腺癌的診斷效能。血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯合診斷胰腺癌的AUC為0.873。

3 討論

胰腺癌是一種病死率非常高的惡性腫瘤，是世界第七大癌癥致死的病因[6]。如果對腫瘤直徑<1 cm的胰腺癌患者行手術為主的綜合治療，則5年生存率可接近100%。所以，發現胰腺癌的早期檢測方法迫在眉睫。而周原等[7]研究表明，DNA甲基化對胰腺癌的早期具有潛在的臨床價值，具有比傳統腫瘤標志物更高的靈敏度和特異度。

HYAL2是一種抑癌因子，作為一種降解透明質酸的酶，參與細胞黏附、 細胞運動、癌癥演進、血管生成和新陳代謝等過程。HYLA2基因低甲基化可能導致該基因表達下調或沉默，最終導致胰腺癌的發生和發展。Xiao 等[8]研究表明，隨著檢驗技術的提高，外周血中循環腫瘤細胞DNA甲基化的檢測靈敏度有很大提升，有望成為胰腺癌早期篩查，無創的檢測方法；并且，DNA甲基化作為一種核酸類的腫瘤標記物，在胰腺癌的診斷方面具有傳統腫瘤標記物所沒有的優勢,比如容易被檢測到、經濟成本低以及早期即可出現等特點[9, 10]。

胰腺癌的病因和發病機制較為復雜，早期無明顯特異性癥狀，發現時往往已至進展期，出現人體多個器官的損害，進而導致肝腎功能等多項指標的改變[11]。本研究中，將胰腺癌患者的常規檢測項目比如血常規和較為特異性的腫瘤標志物CA19-9，以及新指標HYLA甲基化納入單因素及多因素Logistic回歸分析。單因素分析發現對照組患者AMS、LPS和血漿甲基化HYLA2水平大于觀察組組；觀察組患者血漿CA19-9、CEA均高于對照組。提示上述指標與胰腺癌的發生有密切聯系。經多因素分析顯示血漿CEA、CAA19-9以及血漿甲基化HYLA水平是胰腺癌的獨立影響因素，根據OR值對從胰腺疾病中鑒別胰腺癌的影響力依次為：血漿甲基化HYAL2、血漿CA19-9、CEA，且血漿CA19-9較CEA稍準確。這與Chang 等[12]關于胰腺癌早期診斷的研究一致。

將甲基化HYLA2的PMR值分別與血漿CEA、CA19-9進行相關性分析，發現PMR值與兩者均呈負相關，說明隨著血漿CEA、CA19-9增高，甲基化HYAL2水平呈下降趨勢，進而提示血漿低甲基化的HYLA2水平與胰腺癌的發生具有密切關系，同傳統指標一樣，對胰腺癌的診斷具有一定臨床價值。血漿甲基化HYLA2與血漿CA19-9聯合診斷的AUC最大，其次是血漿甲基化HYLA2，CEA的AUC最小。并且血漿甲基化HYLA2單獨診斷胰腺癌的特異度較高，敏感度稍低，提示血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的潛在臨床價值可能優于常規指標，且血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯合診斷，能夠進一步提升其診斷效能，有望成為胰腺癌患者篩查的可靠指標。

然而，本實驗只檢測了血漿樣本的甲基化HYLA2，并未對外周血各樣本中HYLA2進行研究和分析，也未與胰腺組織、胰液等其他樣本進行對照研究，因此可能低估了血漿甲基化HYLA2對胰腺癌的診斷價值。因此，仍需前瞻性研究和大樣本隨機對照試驗，以明確血漿甲基化HYLA2對胰腺癌早期的診斷價值。

綜上所述， 胰腺癌患者血漿甲基化HYAL2發生率較高。血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的靈敏度、特異度均較高。血漿甲基化HYAL2聯合CA199檢測有助于胰腺癌的診斷。