姜黃提取物對小鼠肝纖維化的影響

肖志勇

福建拓天生物科技有限公司，福建 福州 350000

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝病演化為肝硬化的中間必經階段。肝硬化是不可治愈的，而肝纖維化是可治愈的。肝纖維化若及時在早期發現并進行有效的治療，可得到完全逆轉而治愈。四氯化碳（CCl4）是一種常用于誘導構建肝纖維化模型的肝毒素，進入體內會導致血清中谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）與谷丙轉氨酶（cereal third transaminase，ALT）的升高，引起肝損傷，長時間給予CCl4將會導致肝損傷轉化為肝纖維化[1]。

姜黃（Curcuma longaL.）是姜科草本植物，是一種廣泛種植于亞洲的傳統藥草[2]。姜黃中含有包括多酚鐵結合姜黃素復合物和相關姜黃素的高含量的生物活性復合物[3-4]，具有很長的藥用歷史，在中國已有數百年用于治療肝病的歷史[5]。

目前，采用超聲波提取法、研磨提取法及醇提取法等可獲得具有生物活性的姜黃提取物。2016年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準多卡斯生物技術公司（DoCas Biotech）生產的姜黃提取物為食品中“安全使用物質（GRAS）”[6]。姜黃提取物主要成分為姜黃素、脫甲氧基姜黃素，雙脫甲氧基姜黃素等。姜黃提取物有抗腫瘤、抗氧化、抗血脂、促纖溶作用、增強免疫力等功能[7-9]。

姜黃素是一種天然食用色素，亦是姜黃提取物中主要活性成分之一。姜黃素的藥理作用廣泛，包括抗腫瘤、抗炎、保肝等[1]。研究表明，姜黃素可抑制肝癌H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，使CCl4所致肝損傷小鼠血清ALT的升高顯著降低[10]；姜黃素能夠通過顯著抑制CCl4誘導的血清中AST、ALT的升高，增強肝細胞抵抗磷脂氧化的作用，保護生物膜的完整性[11]；姜黃素能減輕CCl4誘導大鼠發生的肝損傷與肝纖維化[12]。這說明姜黃素對肝臟有一定的保護作用。

我們通過建立CCl4誘導型肝纖維化小鼠模型，探究姜黃提取物對小鼠肝纖維化的影響，為開發治療肝纖維化藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠，健康雄性，6周齡，體重18～22 g（南京大學-南京生物醫藥研究院）。

α腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；Masson三色染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 姜黃提取物的制備

稱取50 kg姜黃，重復榨汁2次，姜黃汁和姜黃渣待用；將姜黃汁于60～70℃濃縮至比重為1.1～1.4，獲得姜黃汁濃縮液，待用；姜黃渣置于其重量6倍的75%乙醇中浸泡2 h后，加熱至60～70℃回流提取2 h，獲得以姜黃素等為主要成分的醇提液；醇提后的姜黃渣置于其重量6倍的蒸餾水中，加熱至80℃提取2 h，獲得以多糖為主要成分的水提液；將醇提液和水提液合并，加熱至60～70℃，濃縮至比重為1.1～1.4，獲得提取濃縮液；將姜黃汁濃縮液和提取濃縮液合并，加入濃縮液重量2%的糊精并攪拌均勻，降低濃縮液黏稠度；濃縮液進行噴霧干燥，即獲得姜黃提取物。

1.3 肝纖維化小鼠模型的建立

C57BL/6雄性小鼠12只，隨機分為正常組、模型組、姜黃素提取物給藥組、姜黃素給藥組，共4組，每組3只。除正常組外，其余各組腹腔注射20%CCl4-橄欖油溶液（5 mL/kg體重），1周注射2次，連續注射6周，建立小鼠肝纖維化模型。正常組予以相同劑量的橄欖油皮下注射，注射時間與其余組相同。

1.4 給藥處理

姜黃提取物給藥組和姜黃素給藥組分別用溶于0.1%DMSO的姜黃素提取物和姜黃素進行灌胃（100 mg/kg體重），正常組和模型組小鼠用0.1%DMSO灌胃（100 mg/kg體重）。各組均每天灌胃1次 ，連續灌胃30 d。

1.5 血液采集及血清制備

給藥灌胃實驗結束后，各個小鼠分別稱重，摘除眼球采集血液，離心后獲得血清。

1.6 肝臟采集及處理

將小鼠脫頸，打開腹腔采集肝臟組織，稱取重量。將肝臟組織分為2部分，一部分迅速置液氮中冷凍，-80℃保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，用于HE及Masson染色分析。

1.7 小鼠血清生化指標檢測

利用Ysmex-2100全自動血液分析儀（希森美康生物科技有限公司）檢測小鼠血清中ALT、AST、TC、甘油三酯（triglyceride，TG）指標；采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）測定血清中TNF-α及IL-6的水平。具體檢測操作按相應試劑盒說明書進行。

1.8 小鼠肝臟生化指標檢測

小鼠肝臟中TC、TG、SOD、MDA、GSH-Px指標的檢測按照相應試劑盒說明書進行。

1.9 小鼠肝臟組織病理切片的HE染色和Masson染色

1.9.1 染色前處理 取小鼠肝臟組織塊放入10%福爾馬林中固定，放入一系列濃度梯度的酒精和二甲苯中分別進行脫水和透明，在已溶解的石蠟中進行包埋，切片貼片，放入一系列濃度梯度的二甲苯中脫蠟，再經過一系列從高到低濃度梯度的酒精，最后放入蒸餾水中片刻，即可進行染色。

1.9.2 HE染色 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5 min；酸水及氨水中分色，各10 s；流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻；放入70%和90%酒精中各10 min脫水；放入酒精伊紅染色液中染色2 min；經無水乙醇脫水和二甲苯透明，滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固，即可用顯微鏡觀察。

1.9.3 Masson染色 根據Masson三色染色液的說明書對脫蠟至入水的切片進行Masson染色，染色封固后用顯微鏡觀察。

1.10 數據統計

采用統計分析軟件SPSS19.0分析單因素方差，數據均以x±SD表示，認為P＜0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃提取物對肝纖維化小鼠血清生化指標的影響

姜黃提取物對肝纖維化小鼠血清生化指標的影響如表1所示。與正常組相比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST、TG、TNF-α和IL-6水平顯著升高，而TC則顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比較，姜黃提取物及姜黃素給藥組小鼠血清中的 ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）、IL-6（P＜0.05）均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；姜黃素給藥組的TG也顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），而姜黃提取物給藥組的TG無顯著變化，但2組小鼠血清中的TC無顯著變化；與姜黃素給藥組相比，姜黃提取物給藥組血清的各個指標均無顯著變化。

2.2 姜黃提取物及姜黃素對肝纖維化小鼠肝臟生化指標的影響

結果見表2。與正常組相比較，模型組小鼠肝臟中的TC和SOD均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；TG、MDA和GSH-Px均無顯著變化。與模型組相比，經姜黃素提取物及姜黃素給藥組的小鼠肝臟中TG、TC、SOD、MDA和GSH-Px均無顯著變化。

表1 姜黃提取物對小鼠血清生化指標的影響（x±SD）

2.3 姜黃提取物對小鼠肝臟組織病理的影響

用光學顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織的病理形態，以確定姜黃提取物對小鼠肝臟組織病理的影響，結果如圖1、2。正常組小鼠肝臟組織的匯管區、小葉、肝細胞的膽管未見異常，細胞排列界限清晰，無明顯的膠原纖維沉積，未見纖維增生的現象發生。模型組小鼠肝臟組織的匯管區出現部分炎細胞浸潤；小葉結構異常紊亂，不能分辨；肝臟組織有明顯的膠原纖維沉積，肝細胞的膽管增生明顯，細胞發生明顯壞死。與模型組相比，姜黃提取物給藥組小鼠肝臟匯管區的炎細胞浸潤明顯減少，肝細胞的膽管增生和肝組織膠原纖維含量明顯減少。與姜黃素給藥組相比，姜黃提取物給藥組無顯著差異。

3 討論

纖維化在多種器官（大腦、肺臟、心血管系統、腎臟、胰腺等）中均可發生，持續發展將嚴重致死。肝臟具有生物轉化作用，是機體內代謝及排毒的重要器官，因而也是用于研究纖維化的理想器官。迄今，大多關于纖維化的研究都是在動物肝臟中進行的。相較于檢測肝纖維化的一般血清標志物［如層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、ALT及AST等］，新型血清分子標志物（如非編碼RNA、成纖維細胞因子、ECM相關標志物及分子組學等）能準確鑒別肝纖維化的程度，有助于更全面地分析肝纖維化病因[13]。

目前，治療肝纖維化的藥物療效并不理想，安全有效的藥物有待開發，此研究方向已受到國內外重視[14]。研究表明，中草藥植物及從中提取的有效成分對肝纖維化具有治療作用[15-16]。已有研究表明，采用灌胃方法進行姜黃提取物給藥，對小鼠的精神神經系統、血壓、呼吸及心電圖的影響不明顯[17]。2016年美國FDA已批準姜黃提取物為食品“安全使用物質”[6]，而姜黃素是姜黃提取物中的主要生物活性成分，說明姜黃提取物及姜黃素均是相對安全的藥物。本實驗研究了姜黃提取物對CCl4誘導小鼠肝纖維化的影響，結果證明姜黃提取物有改善肝纖維化的作用。實驗結果表明，姜黃提取物及姜黃素給藥的2組小鼠之間的指標及病理學形態無顯著差異，即姜黃提取物與姜黃素兩者的效果相當，說明在小鼠肝纖維化治療恢復中，姜黃提取物的有效成分姜黃素起主要作用。相比于姜黃素的提取純化操作復雜及高成本，姜黃提取物的制備操作簡單，成本低，作為治療肝纖維化的藥物具有一定的優勢。因此，本實驗為開發新型低成本的安全、有效、理想的治療肝纖維化藥物奠定了基礎。

表2 姜黃提取物對小鼠肝臟生化指標的影響（x±SD）

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學形態（HE，×100）

圖2 各組小鼠肝臟組織病理學形態（Masson，×400）