呼吸道合胞病毒F1片段膜外區的原核表達及其多克隆抗體制備

張樂，鞏新，劉波，吳軍

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬副黏病毒科肺炎病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，是世界范圍內引起嬰幼兒病毒性急性下呼吸道疾病（acute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原體[1]。2歲以下的兒童中，因感染RSV而住院治療的人數約占呼吸道疾病住院率的50%，其中2～4月齡的嬰兒是住院主要人群[2]。據報道，幾乎所有的兒童在2歲時都經歷過RSV感染，而生命中出現反復感染是由于免疫力低下[3]。虛弱的老年人在感染RSV后死亡率大幅增加，通常表現為心臟和肺部疾病的并發癥以及肌力減弱。由于嚴重的聯合免疫缺陷癥、異體骨髓移植或衰老而導致肺部CD8 T細胞功能減退的人也會因感染RSV而患上嚴重疾病。目前尚未有安全有效的RSV疫苗上市，世界衛生組織已將研制RSV疫苗列為全球疫苗計劃的優先發展計劃之一。

RSV基因組全長15 222 bp，編碼11種蛋白，其中F蛋白和G蛋白是主要的保護性抗原[4]，根據G蛋白的差異可以分成A、B共2個亞型[5]。F蛋白在不同亞型間相對保守，蛋白同源性高達90%，可誘導同時抵抗A、B亞型感染的中和抗體，并且在病毒顆粒侵入宿主細胞，與細胞融合過程中起重要作用[6]，因此較多的抗體、疫苗研究都集中在F蛋白。

RSV的F蛋白是包含574個氨基酸殘基的Ⅰ型糖蛋白，根據菌株的不同，F蛋白有5～6個N糖基化修飾。在合成過程中，RSV首先合成F蛋白前體（F0），為N端糖基化蛋白，沒有受體結合活性，3個F0單體組裝成1個三聚體，當三聚體穿過高爾基體時，單體被蛋白酶酶切，其N端和C端產物分別為F2和F1片段，通過二硫鍵連接[7]，主要的抗原表位多集中于F1片段，例如抗原位點Ⅱ（255～275殘基）和Ⅳ（422～438殘基），其中F蛋白的抗原位點Ⅱ就是美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的人源化鼠單克隆抗體——帕利珠單抗（Palivizumab）的識別表位[8]。F蛋白的研究在RSV的治療與預防方面占有較大比重，但缺乏商業化的高效、特異性的RSV F蛋白檢測抗體。因此，我們選取RSV F蛋白抗原表位較集中的F1片段膜外區作為目的片段（圖1）[9]，利用原核表達系統獲得目的蛋白，免疫大耳白兔，收集血清抗體，同時利用哺乳動物細胞表達RSV F蛋白膜外區作為Western印跡檢測的目的抗原，檢測證明血清抗體的特異性。制備的多克隆抗體為后續RSV F蛋白疫苗的研究及單克隆抗體的制備奠定了基礎。

圖1 呼吸道合胞病毒F蛋白結構圖

1 材料與方法

1.1 材料

2 kg以上雌性大耳白兔購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；人胚腎細胞HEK293T、表達質粒pET-28a由本實驗室保存；大腸桿菌Trans5α、BL21（DE3），TaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；Q5熱啟動高保真DNA聚合酶、NdeⅠ和XhoⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶、彩色預染蛋白marker購自NEB公司；異丙基-β-D硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）購自北京欣經科生物技術有限公司；帶有HRP的抗His標簽單克隆抗體購自Abmart生物醫藥（上海）有限公司；RSV F蛋白全基因序列及PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；質粒小提中量試劑盒、DNA純化回收試劑盒、化學發光檢測試劑盒購自天根生物科技有限公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑、LipofectAMINE 3000轉染試劑購自ThermoFisher公司；Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP購自Sigma公司。

1.2 目的基因的獲取

在NCBI網站檢索獲取RSV F蛋白的全長基因序列（GenBank：FJ614814.1）,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據文獻報道，選取抗原表位較集中的F1片段膜外區（137～523殘基）設計引物 RSV F1-5（5′-GGGCATATGTTCCT GGGTTTCCTATTGGGA-3′，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點）和 RSV F1-3（5′-AAACTCGAGGCCGCC GCCGCCAATCGTAGATTTGCCGGCATTGAC-3′，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點），添加His-Tag，PCR擴增RSV F1-His基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收PCR片段。

1.3 大腸桿菌表達載體F1-His-pET-28a的構建

質粒pET-28a及PCR回收片段經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切處理后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及回收，用T4DNA連接酶將RSV F1片段與線性質粒連接，并將連接產物轉化大腸桿菌Trans5α感受態細胞，菌落PCR篩選陽性克隆后委托華大基因公司對其進行測序分析，測序正確的單克隆接種含卡那霉素的LB液體培養基，37℃過夜培養，用質粒提取試劑盒提取重組表達質粒，命名為pET28a-F1-His。

1.4 pET28a-F1-His在原核細胞中的表達與純化

將pET28a-F1-His轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，挑取單克隆接種含卡那霉素的LB液體培養基，37℃振蕩培養過夜，按5%的接種量接種至含卡那霉素的Ⅰ號培養基中，培養至菌液D600nm值達0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達，37℃繼續培養8 h后離心收集菌體，用水重懸，超聲波破碎菌體后于12 000 r/min離心10 min，分離上清和沉淀；用同樣方法培養和誘導大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對照，通過Western印跡檢測目的蛋白是否表達。

將確定表達的菌株擴大培養，超聲波破菌后收集破菌沉淀，用pH9.0的Tris-HCl、8 mol/L尿素洗滌，12 000 r/min離心30 min，沉淀經pH8.5的Tris-HCl、6 mol/L胍鹽溶解1 h，離心后調整上清pH值至7.5，進行鎳離子親和層析柱純化，收集純化洗脫液，透析至PBS緩沖液中，用12%分離膠進行SDS-PAGE分析。

1.5 抗RSV F蛋白多克隆抗體的制備

選擇2 kg以上的雌性大耳白兔，將從SDSPAGE凝膠上切下的目的蛋白膠條用研缽碾磨，加入適量生理鹽水重懸作為抗原，首次免疫混合等量的弗氏完全佐劑，冰浴超聲波混勻后，背下皮下多點免疫；此后的加強免疫均與弗氏不完全佐劑等量混合，分別于2周后、4周后進行第2次和第3次免疫，最后一次免疫10 d后勁動脈取血，4000 r/min離心20 min分離血清，分裝后保存于-80℃。

1.6 Western印跡檢測多克隆抗體的特異性

用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養HEK293T細胞，接種至24孔板，每孔約2×105細胞，培養過夜，待匯合度為70%～90%時，采用LipofectAMINE 3000轉染表達RSV F蛋白膜外區的質粒，6 h后更換新鮮培養基，同時培養HEK293T空細胞作為陰性對照，48 h后一同收集培養上清。將培養上清進行12%的SDS-PAGE，半干法轉印到PVDF膜上，用5%的牛奶封閉液室溫封閉1 h，對照組用抗His-tag（稀釋度為1∶5000）抗體孵育，實驗組以收集的兔血清為一抗，5%牛奶稀釋（稀釋度為1∶2000）孵育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min，轉到用5%牛奶以1∶5000稀釋度稀釋的二抗（Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP）孵育1 h，PBST洗滌，用化學發光檢測試劑盒檢測熒光強度。

2 結果

2.1 原核表達載體pET28a-F1-His的構建及鑒定

設計引物對F1片段膜外區進行PCR擴增（圖2A），純化回收PCR產物，同時與表達載體pET-28a一同酶切，純化回收酶切產物；用T4DNA連接酶連接目的片段與載體，構建重組質粒pET28a-F1-His（圖3）；轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，菌落PCR鑒定陽性克隆（圖2B）；將陽性克隆委托測序，測序結果顯示插入表達載體pET28a-F1-His的F1編碼序列完全正確。

圖2 RSV F基因的PCR產物擴增圖譜（A）及菌落PCR篩選鑒定陽性克隆（B）

圖3 pET28a-F1-His表達質粒結構圖

2.2 重組表達載體在原核細胞中的表達及純化

將重組表達載體pET28a-F1-His轉化宿主菌，與大腸桿菌BL21（DE3）空白菌同條件培養，IPTG誘導表達，破碎菌體并離心后進行Western印跡，全菌裂解液及離心后的沉淀中在相對分子質量約44×103處均存在蛋白條帶（圖4A），與理論大小一致，說明pET28a-F1-His在大腸桿菌中得到表達且以包涵體形式存在；在相對分子質量約32×103處有一條帶，可能為蛋白降解條帶。擴大培養陽性克隆，收集菌體，破菌、溶解后進行鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE分析結果顯示，在相對分子質量約44×103處有與目的條帶大小一致的條帶（圖4B），表明通過洗滌和溶解純化的過程，獲得了相對較純的RSV F1蛋白。切膠碾磨44×103處的目的條帶，進行免疫。

圖4 F1蛋白膜外區在原核細胞中表達的Western印跡（A）及純化圖（B）

2.3 RSV F蛋白兔源多克隆抗體特異性檢測

以3次免疫后獲得的兔源血清抗體作為一抗（稀釋度為1∶2000），帶HRP標記的山羊抗兔抗體作為二抗進行Western印跡，檢測血清中多克隆抗體的特異性，同時以抗His-tag抗體（稀釋度為1∶5000）為對照，HEK293T細胞表達的RSV F蛋白的膜外區作為檢測用目的蛋白。F全長蛋白在表達過程中會被酶切成F1（相對分子質量44×103）、F2（相對分子質量18×103）2個片段，Hig-Tag添加在F1 C端。結果顯示，在相對分子質量約44×103處檢測到目的蛋白（圖5A），HEK293T空細胞中無條帶，與抗His-tag抗體檢測結果一致（圖5B）；對應的SDS-PAGE分析顯示培養上清存在較多雜蛋白，說明制備的兔源多克隆抗體能特異性檢測出RSV F蛋白的表達。

圖5 HEK293T細胞表達RSV F蛋白的膜外區Western印跡（A）及 SDS-PAGE（B）

3 討論

RSV F蛋白較為保守，能夠激發機體產生保護性抗體，又能誘發輔助T細胞的免疫應答，在病毒顆粒侵入宿主細胞時，促使病毒與細胞之間膜的融合，同時還會導致細胞之間發生融合，形成合胞體[10]，是RSV研究中的重要蛋白。由于缺乏特異性的RSV F蛋白檢測抗體，實驗研究中多采用His-tag抗體進行檢測，而在疫苗的研發及制備中不能攜帶His-tag等外源標簽，使得后續操作須去除His-tag，具有一定的局限性，因此，特異性的RSV F蛋白多克隆抗體研制極具意義。本研究利用原核細胞表達RSV F蛋白的F1片段膜外區，并制備兔源多克隆抗體，為RSV F蛋白的研究提供檢測抗體，為深入探索F蛋白在RSV感染致病機理中的作用機制以及疫苗的開發奠定了基礎。

RSV是引起兒童及老年人嚴重下呼吸道疾病的主要原因，由于感染反復多發，波及人群廣，導致了較高的住院率及死亡率，造成了一定的社會經濟負擔[11]。目前，在RSV感染的治療方面，采用的核酸類似物利巴韋林屬于廣譜抗病毒藥物，大劑量長期使用可能會出現白細胞減少，引起溶血性貧血等副作用；單克隆抗體Palivizumab（Synagis）可抑制病毒進入細胞，但價格十分昂貴，限制了其廣泛使用；而其多克隆抗體雖占有較大的市場份額，但由于是血源制品，來源有限且有污染的可能，存在較大風險[12]。盡管隨著數十年來醫學生物學的發展，RSV的疫苗研究取得了一定的進展，但目前還沒有相應的疫苗上市，大部分疫苗的研究主要集中于F蛋白，部分基因載體疫苗、亞單位疫苗及減毒活疫苗已進入臨床試驗，能否誘發機體產生有效的保護性抗體，誘導平衡的Th1/Th2型應答是RSV疫苗研究的熱點[13]。我們希望針對這些重要呼吸道病原的安全、有效的疫苗或藥物可以盡早出現。