銅綠假單胞菌外膜蛋白OprⅠ原核表達載體的構建及其在大腸桿菌中的表達

劉瀟，李文桂,羅廣旭

重慶醫科大學附屬第一醫院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,Pa）是醫院內感染的主要致病菌之一。Pa易定植且易耐藥，可導致囊性纖維化或免疫力低下等患者發生難治性感染[1-2]。2014年全國醫院感染橫斷面調查報告顯示，下呼吸道感染所分離的病原體中Pa數量（1573/7477株）居首位[3]。2016年中國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示，廣泛耐藥的Pa菌株檢出率為2.1%，呈上升趨勢[4]。若Pa感染未得到及時治療或徹底治愈，轉變為慢性感染，會使得治療難度加大。疫苗的應用彌補了細菌的耐藥性和抗菌藥物長期大量使用產生的菌群失調等不足，為Pa的防治提供了新的思路[5]。

外膜蛋白Ⅰ（outer membrane proteinⅠ，OprⅠ）是一種結合在肽聚糖上的脂蛋白[6]，其脂質尾是其有效發揮多種類型免疫應答的重要成分之一[7-8]。Westritschnig 等[9-10]將 OprⅠ疫苗免疫健康志愿者，發現其可誘導血清特異性IgG抗體升高，提示OprⅠ是一種有希望的疫苗分子。我們擬將OprⅠ基因插入原核表達載體pGEX-1λT，構建pGEX-OprⅠ，再將其電穿孔轉化大腸桿菌BL21（DE3），研究該重組質粒在大腸桿菌中的表達，為Pa疫苗研制提供有價值的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

Pa的PA01株由重慶醫科大學附屬兒童醫院余加林教授惠贈；pGEX-1λT和大腸桿菌BL21（DE3）由本室保存。

DNA抽提試劑盒、PCR擴增試劑盒、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒購于上海生工公司；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶購于Fermentas公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購于北京鼎今生物科技公司；Pa感染的鼠血清、LB液體和固體培養基由本室保存。

恒溫搖床購于日本三洋公司；高速離心機、電穿孔儀購于德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像分析儀、電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 OprⅠ基因的擴增及鑒定

根據GenBank中Pa的OprⅠ基因序列和pGEX-1λT 載體特點設計引物 P1（5′-GCGGATTC TGAGCAGCCACTCCAAAGAAACGAAGCT-3′，下劃線處為BamHⅠ酶切位點）、P2（5′-GCGAATTCCT ATTACTTGCGGCTGGCTTTTTCC-3′，下劃線處為EcoRⅠ酶切位點），由上海生工公司合成。取Pa菌種PA01株加入LB液體培養基中，37℃、220 r/min振蕩培養48～72 h至細菌濃度約為109/mL，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，按照DNA抽提試劑盒說明書提取DNA。以Pa基因組DNA為模板，以P1和P2為引物，PCR擴增OprⅠ片段。50 μL PCR反應體系包括2×PCR Master 25 μL、引物各 2 μL、DNA 模板 3 μL、滅菌雙蒸水 18 μL。擴增條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸2 min。取PCR產物5 μL進行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 重組質粒pGEX-OprⅠ的構建

將 BL21（pGEX-1λT）接種在氨芐青霉素（Amp）濃度為50 μg/mL的LB固體培養基上，37℃培養16～18 h，挑選單克隆菌落接入Amp濃度為50 μg/mL的LB液體培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養48～72 h，用質粒抽提試劑盒提取pGEX-1λT。

OprⅠ的PCR擴增產物和載體pGEX-1λT均經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切體系總體積均為 60 μL，包括 42 μL 擴增產物或載體、1.3 μLBamHⅠ、1.3 μLEcoRⅠ、6 μL 10×Tango緩沖液、9.4 μL滅菌雙蒸水。37℃水浴酶切2 h。按照PCR產物純化試劑盒說明書對酶切產物進行純化。

將OprⅠ基因片段與載體片段混勻（摩爾比5∶1），連接體系（20 μL）包括 OprⅠ基因片段 4μL、載體片段12 μL、10×T4DNA連接酶緩沖液2 μL、T4DNA連接酶2 μL。5000 r/min離心15 s，4℃連接過夜，70℃水浴10 min滅活連接酶。

按照高效感受態細胞制備試劑盒說明書制備感受態大腸桿菌 BL21（DE3）。取 80 μL 感受態菌液與20 μL連接產物充分混勻，冰浴1 min，轉移至電擊杯中。電穿孔（電穿孔參數：0.8～2.5 kV，5 ms/次，1～5次）結束后繼續冰浴5～10 min，然后轉移至培養管中，37℃、150 r/min振蕩培養1 h，取適量菌液劃線接種至含 Amp（50 μg/mL）的LB固體培養基上，37℃培養72 h。

1.4 重組質粒pGEX-OprⅠ的鑒定

挑選單克隆菌落接入含 Amp（50 μg/mL）的LB液體培養基中，37℃、200 r/min培養48～72 h，收集菌體，抽提質粒，用上述酶切體系進行雙酶切鑒定。以抽提的質粒為模板，按上述方法擴增OprⅠ基因。

1.5 大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）的誘導表達及SDS-PAGE分析

陽性重組菌振蕩培養至菌液D600nm值為0.5～0.8，取部分做對照，其余加入1 mmol/L的IPTG，分別在誘導后1、3、5、7、9、11和13 h收集菌體，與50 μL 1×蛋白加樣緩沖液混勻，煮沸5 min，分別取20 μL加樣進行SDS-PAGE。

1.6 Western印跡鑒定

SDS-PAGE結束后，150 mA、2 h恒流電轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，用1∶100稀釋的Pa感染的鼠血清（一抗）室溫孵育2 h，用1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG（二抗）室溫孵育2 h，用現配的二氨基聯苯胺顯色液避光反應15～20 min進行顯色并成像。

2 結果

2.1 OprⅠ抗原編碼基因的鑒定

以PA01株的基因組DNA為模板進行PCR，可獲得約194 bp的OprⅠ基因片段（圖1）。

圖1 OprⅠ抗原編碼基因PCR擴增產物鑒定

2.2 重組質粒pGEX-OprⅠ的雙酶切鑒定

以pGEX-1λT空載體為對照，從具有Amp抗性的重組菌中提取重組質粒，經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后產生約4947 bp的pGEX-1λT載體片段和194 bp的OprⅠ基因片段（圖2）。

圖2 pGEX-OprⅠ的雙酶切鑒定

2.3 重組質粒pGEX-OprⅠ的PCR鑒定

從具有Amp抗性的重組菌中抽提質粒，以此為模板，以P1和P2為引物進行PCR，可擴增出約194 bp的OprⅠ基因片段（圖3）。

圖3 重組質粒pGEX-OprⅠ的PCR擴增產物鑒定

2.4 大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達產物的SDS-PAGE分析

IPTG誘導BL21（pGEX-OprⅠ）表達相對分子質量（Mr）約32 000的GST-OprⅠ融合蛋白（GST的Mr約 26 000，OprⅠ的Mr約 6000）。凝膠成像分析結果提示蛋白表達量在IPTG誘導3～5 h時較高，融合蛋白約占菌體總蛋白的20%（圖4）。

圖4 重組菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達產物的SDS-PAGE分析

2.5 Western印跡鑒定

Pa感染的鼠血清可識別大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達的GST-OprⅠ蛋白，識別的條帶Mr約32 000，與預期相符（圖5）。

圖5 BL21（pGEX-OprⅠ）表達產物的Western印跡鑒定

3 討論

Fruh等[11]以pITaq1為模板擴增OprⅠ基因，將其克隆入pQE構建pQE8-I，轉化大腸桿菌M15/pREP4，IPTG誘導表達Mr約8000的重組OprⅠ蛋白，Western印跡證實小鼠單克隆抗體（mAb）2A1可識別該重組OprⅠ蛋白，von Specht等[10]將此重組OprⅠ蛋白免疫健康志愿者可誘導特異性免疫應答。Finke等[12-13]將OprⅠ基因克隆至pTaq獲得重組質粒pITaq1，轉入大腸桿菌表達Mr約8000的重組OprⅠ蛋白，Western印跡提示表達的OprⅠ蛋白可與小鼠mAb結合，以純化的重組OprⅠ蛋白接種小鼠可誘導其產生抵抗Pa感染的保護力。陳春琳等[14]提取PA01株基因組DNA，PCR擴增獲得252 bp的OprⅠ基因，與pET-32a連接獲得重組質粒，轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達Mr約30 000的OprⅠ融合蛋白，Western印跡證實免疫鼠血清可識別該融合蛋白，純化的OprⅠ蛋白免疫昆明鼠可產生顯著的保護力。這些研究表明OprⅠ蛋白能夠誘導機體產生較好的保護性免疫應答，在Pa疫苗的研究方面具有重要價值。

本研究采用大腸桿菌表達系統。大腸桿菌作為宿主菌具有遺傳背景清楚、可供選擇的高效表達載體多、目標蛋白表達量較高、培養條件簡單且周期短和不易污染等優點。BL21（DE3）是常用的蛋白酶基因缺陷株，可使目標蛋白的穩定性較其他表達菌株增強。pGEX-1λT源于pBR322，是一種以大腸桿菌為宿主菌的高效融合型表達載體，pGEX-1λT的多克隆位點上游有一個谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）基因和一個凝血蛋白酶切割位點的編碼序列，目標基因插入后，產生的融合蛋白由3個序列構成。GST在大腸桿菌中容易表達，與其構成的融合蛋白具有較高的可溶性和酶活性。GST基因上游的tac啟動子由lacUV5的Pribnow序列與trp啟動子的-35序列拼接而成，其mRNA轉錄水平遠高于lacUV5和trp啟動子，所有的tac啟動子都可被IPTG誘導進而高效表達外源基因。近年來，眾多學者使用pGEX-1λT和BL21（DE3）研究目的基因的表達，張寧等[15]利用pGEX-1λT使日本血吸蟲Sj-14-3-3基因在BL21（DE3）中表達，張麗等[16]將日本血吸蟲Sj26GST基因插入 pGEX-1λT，導入 BL21（DE3）后可表達目的蛋白。本研究構建了重組大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ），其表達的融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特異性識別，與上述研究[14-16]相似，提示OprⅠ基因可在BL21（DE3）中表達，且表達的蛋白具有抗原性。