貝母中環阿屯醇合成酶的生物信息學分析

許勇，李靜，蔡標，王紅萍，戴陳偉，王娟

安徽省醫學科學研究院 微生物研究所，安徽 合肥 230061

貝母是傳統的藥用植物，其鱗莖入藥具有止咳化痰、清熱散結等功效，在我國主要分布于四川、新疆、甘肅、湖北、安徽、浙江等省區[1-2]，包括川貝母、浙貝母、暗紫貝母、皖貝母等多個品種。貝母甲素、貝母乙素、爐貝甲素、川貝酮和西貝素等5α-瑟文類異甾體生物堿是貝母的主要生物活性成分[2]。

環阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）屬于氧化鯊烯環化酶（oxido squalene cyclase，OSC）家族，能夠催化2，3-氧化鯊烯環化生成環阿屯醇，不僅是植物甾醇合成過程中的關鍵酶，同時又是三萜類物質合成的重要調控位點[3]。研究表明，貝母甲素等生物堿與萜類化合物合成途徑相似，都屬于甲羥戊二酸（mevalonic acid，MVA）途徑，因此，CAS也是貝母素甲等生物堿的合成途徑中的關鍵酶[4]。

應用生物信息學手段，分析預測藥用植物中生物活性物質合成途徑中關鍵蛋白質的性質、結構和功能，在對其生物合成機制的研究中得到廣泛應用。已有學者用生物信息學手段對紅花中的查爾酮合成酶[5]和金銀花綠原酸合成酶[6]進行了預測分析，探究其生物活性物質的合成機制。

本研究旨在通過ProtParam、SignalP4.1、Scan-Prosite、ProtScale和SWISS-MODEL等生物信息學手段，分析預測貝母中環阿屯醇合酶的性質、結構和功能，為進一步研究貝母活性生物堿的生物合成調控機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

浙貝母（Fritillaria thunbergii）環阿屯醇合成酶（FtCAS）氨基酸序列下載自NCBI網站（Gen-Bank登錄號：AEO27878）。

1.2 生物信息學分析

利用ProtParam分析浙貝母環阿屯醇合成酶的理化性質，SignalP[7]預測信號肽，PSORT預測細胞亞定位，TMHMM進行跨膜結構分析，ProtScale預測親疏水性[8]，SOMPA預測二級結構[9]，Predict-Protein[10]預測二硫鍵，PROSITE預測功能位點，COILS[11]預測卷曲螺旋，SWISS-MODEL[12-16]進行同源建模，用MolProbity軟件中的Ramachandran[17]對建模結果進行評估，3DLigandSite[18]預測配體結合位點。

2 結果

2.1 FtCAS的一級結構及理化性質分析

ProtParam分析結果顯示FtCAS由756個氨基酸殘基組成（表1），其中比例最高的為Leu（9.5%），比例最低的為Cys（2.4%）。FtCAS的相對分子質量為85 507.69，理論等電點（pI）為6.02，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）總數為82，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）總數為69，半衰期大于20 h，不穩定系數36.85，總平均親水系數為-0.223，是穩定的親水性蛋白質。

表1 FtCAS的氨基酸組成

2.2 FtCAS的信號肽、亞細胞定位、跨膜結構域和親疏水性分析

通過SignalP4.1 Server分析發現，FtCAS的自然分裂位點分值（C-Score）的峰值為0.118（第38位），組合分裂位點分值（Y-Score）的峰值為0.123（第12位），不存在信號肽（圖1）。PSORT細胞亞定位預測FtCAS位于細胞質中的微體或過氧化物酶體。應用TMHMM Server v.2.0對FtCAS進行跨膜結構分析（圖2），發現該蛋白不含跨膜結構域（TMHs），非跨膜螺旋區（ExpAA）為 15.8607（＜18），預測表明該蛋白非跨膜蛋白；蛋白的N端位于膜內側的概率為0.029 74，該序列總體位于膜外。通過ProtScale對FtCAS的氨基酸序列的親疏水性進行在線預測，多肽鏈中的第126位脯氨酸的疏水值為1.944，是疏水性最強的氨基酸，第358位谷氨酸的疏水值為-2.778，是親水性最強的氨基酸。N端和C端都是負值，都顯親水性，整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數多于疏水性氨基酸殘基（圖3），可以預測FtCAS為可溶性親水蛋白。

圖1 SignalP4.1預測FtCAS的信號肽

圖2 TMHMM分析FtCAS的跨膜性

圖3 ProtScale預測FtCAS的親疏水性

2.3 FtCAS的二級結構分析

利用SOMPA對FtCAS的二級結構進行分析預測，發現其二級結構中，α螺旋占43.92%（332個氨基酸殘基），延伸鏈結構占13.76%（104個氨基酸殘基），β轉角占7.14%（54個氨基酸殘基），無規卷曲占35.19%（266個氨基酸殘基）。α螺旋和無規卷曲是FtCAS二級結構的主要構成原件。

PredictProtein預測結果表明FtCAS中不存在二硫鍵；PROSITE蛋白質功能位點分析發現1個萜類合酶位點（603～617 aa），其氨基酸序列為DGSWYGSWAVCFTYG。

2.4 FtCAS的卷曲螺旋域分析

如表2所示，通過COILS分析，發現FtCAS在Window=14時卷曲概率最高，為0.142，小于0.5，所以FtCAS不含卷曲螺旋結構。

表2 COILS預測的最高傾向性氨基酸區段

2.5 FtCAS的三級結構建模及結合位點預測

如表3和圖4，SWISS-MODEL建模以PDB ID1w6j.1的A鏈為模板，序列一致性為50.16%，相似度0.44，覆蓋度0.84，功能預測為羊毛甾醇合成酶。模型的總體評價為0.69，Qmean為-2.60。Ramachandran評估結果表明同源建模顯示氨基酸位點都位于最佳區域內的占94.8%（614/648），氨基酸位點位于允許區域范圍內的占98.5%（638/648），說明所建三級結構模型均準確可靠（圖5）。3DLigandSite以PDB ID 1w6k的A鏈為折疊子，預測得到FtCAS的結合配體為 Zn2+，結合位點為 676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala（圖6）。

表3 FtCAS同源建模及功能預測

圖4 SWISS-MODEL對FtCAS三級結構的預測

圖5 MolProbity Ramachandran分析FtCAS的三級結構

圖6 3DLigandSite預測FtCAS配體結合位點圖中藍色部分為配體結合位點

3 討論

FtCAS整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數多于疏水性氨基酸殘基，其二級結構中富含α螺旋和無規卷曲，有助于保持蛋白質結構的穩定，總體來說，FtCAS是穩定的親水性蛋白質。根據信號肽分析、亞細胞定位和跨膜結構域預測，FtCAS是位于細胞質內微體中的非分泌蛋白，和其所催化的MVA途徑反應場所一致[19]，這也證明了預測的可靠性。

FtCAS中不含二硫鍵，這可能是由于其Cys殘基含量低并且在催化功能中發揮關鍵作用[20]。蛋白質分子內或分子間的卷曲螺旋結構主要與分子識別、細胞骨架和細胞運動等功能相關[21]，Ft-CAS中不含卷曲螺旋結構也不發揮上述功能。

萜類合酶是萜類合成的核心酶，其催化產物多為環狀，又稱環化酶[22]。FtCAS的603～617 aa區域被預測為功能位點，發揮萜類合酶作用，與該酶的功能相符。萜類合酶的催化過程需要金屬離子作為輔助因子[22]，FtCAS的輔助因子可能為 Zn2+，結合位點為676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala。

CAS和羊毛甾醇合成酶的催化底物都是2，3-氧化鯊烯，產物環阿屯醇和羊毛甾醇為同分異構體，催化過程中2，3-氧化鯊烯都會經歷“椅-船-椅”構象，產生C-20原甾醇陽離子中間體，并進行骨架重組，最終生成終產物[3]。因此，SWISSMODEL和3DLigandSite都以羊毛甾醇合成酶為模板，建立FtCAS的三級結構模型。

通過生物信息學手段對FtCAS的分析預測結果與其實際功能有很強的聯系，證明預測結果的可靠性較高，可以以此為基礎進一步探討貝母中生物堿合成的調控機制。