肝靶向肽-抗腫瘤肽CSP-MDA-7/IL-24融合基因原核表達條件優化

陳瑜麗，張晶晶，馬艷，盧雪梅，劉文彬 ，金小寶 ，汪潔

1.廣東藥科大學 基礎學院 藥用生物活性物質研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006

肝靶向肽CSP I-plus是從瘧原蟲環子孢子蛋白（circumsprozoite protein，CSP）中篩選得到的能夠特異識別并黏附在肝細胞表面的多肽序列。肝靶向肽能與肝細胞表面受體硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）特異性結合，將具有藥物活性的物質富集于肝臟部位，發揮其生物學功能[1-2]。黑色素瘤分化相關基因 7（melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7）是Fisher等[3-4]于1995年發現的具有細胞因子樣特性的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白具有廣譜抗腫瘤活性，有強大的“腫瘤特異性旁觀者效應”，可對周圍甚至遠處轉移的腫瘤細胞產生凋亡誘導效應，對控制腫瘤復發具有重要的臨床意義，但對正常細胞無任何毒性[5-9]。后來發現MDA-7與白細胞介素10（IL-10）細胞因子家族基因具有同源性和親緣關系，屬于IL-10家族，因此，2001年被重新命名為白細胞介素24（IL-24）。研究表明，MDA-7/IL-24在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，其表達水平與腫瘤大小、病理分級和血清甲胎蛋白（AFP）呈明顯的負相關，且隨著肝癌惡性程度的增加表達水平減少或缺失[10]?；诟伟邢蚝涂鼓[瘤的雙重作用，本實驗室利用基因工程技術構建了肝靶向肽-抗腫瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）融合基因，期望用于肝癌術后治療，減少術后復發率和提高生存率。如何獲得大量重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24以滿足其開發應用和研究須進一步探索。我們對誘導時間、培養基pH值、誘導溫度和誘導劑IPTG濃度各選取5個水平進行正交試驗，對重組蛋白進行條件優化，為重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24的規?；a和活性評價奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24由廣東省生物活性藥物研究重點實驗室保存；大腸桿菌表達載體pET21b及大腸桿菌BL21由本實驗室保存。丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED（BioRad公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）；異丙基-β-D-硫代半糖（IPTG）（Sigma公司）；氨芐青霉素（Amp）（Amresco公司）；蛋白預染marker（Fermentas公司）。

1.2 重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24的構建

將CSP-MDA-7/IL-24融合基因的PCR產物純化后，分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切重組克隆載體CSP-MDA-7/IL-24和質粒表達載體pET21b，用T4DNA連接酶將克隆載體雙酶切得到的小片段與質粒pET21b連接構建重組表達載體pET21b-CSP-MDA-7/IL-24，經鑒定為陽性后轉化大腸桿菌DH5α感受態，轉化菌種涂于含Amp的LB固體培養基上，37℃恒溫箱培養16～18 h，獲得重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24。

1.3 生長曲線測定

接菌環取一環重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24甘油種子劃在LB平板上，37℃過夜培養后挑取單菌落接種到LB液體培養基中，37℃、180 r/min培養過夜，按體積比 1∶100接入LB培養基中擴大培養，此時開始計時，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8和 9 h各取1 mL菌液測定D600nm值，以時間為橫坐標、D600nm值為縱坐標，繪制表達菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24的生長曲線，以研究其生長規律，確定最佳誘導時機。

1.4 單因素分析誘導表達條件

1.4.1 誘導時間對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 將培養過夜的重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24菌液加到 300 mL 含 100 μg/mL Amp的LB培養基中，體積比為1∶100，37℃搖床培養2.5 h至D600nm值為0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于37℃搖床中振蕩培養，分別于0、1、2、3、4、5、6、7和8 h取樣，4℃、12 000 r/min離心5 min收集各樣品中的菌體，分別加入160 μL 1×Tris-HCl和 40 μL 5×SDS 上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達的最佳誘導時間。

1.4.2 培養基pH值對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 將培養過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100加到pH值分別為4、5、6、7、8、9和10的含100 μg/mL Amp的LB培養基中，37℃振蕩培養2.5 h至D600nm值為0.6時，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導劑IPTG，振蕩培養4 h，取樣進行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達的最佳培養pH值范圍。

1.4.3 誘導溫度對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 將培養過夜的重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100 μg/mL Amp的LB培養基中，37℃振蕩培養2.5 h至D600nm值為0.6時，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導劑IPTG，分別于17、22、27、32、37、42℃振蕩培養4 h，取樣進行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達的最佳誘導溫度。

1.4.4 誘導劑IPTG濃度對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 將培養過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100 μg/mL Amp的 LB培養基中，37℃振蕩培養2.5 h至D600nm值為0.6時，分別加入誘導劑IPTG至終濃度為 0.00、0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L，37℃振蕩培養 4 h，取樣進行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達的最佳誘導劑IPTG濃度。

1.5 正交設計優化誘導表達條件

根據單因素分析結果，用正交設計助手V3.1設計正交試驗L25（45），以不同誘導時間（2、3、4、5、6 h）、不同培養基pH值（6、6.5、7、7.5、8）、不同誘導溫度（32、34.5、37、39.5、42℃）和不同誘導劑IPTG 濃度（0.03、0.06、0.12、0.25、0.50 mmol/L）四因素五水平進行表達優化，研究BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌高水平表達的規律。

2 結果

2.1 BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長曲線分析

生長曲線反映了工程菌的生長變化趨勢，可以確定該重組菌株在某一時刻所處的生長階段，依此為依據，選擇合適的誘導條件進行誘導。由BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長曲線（圖1）可見，培養2～3 h時菌株處于對數生長期。

圖1 重組菌株BL21/p ET21b-CSP-MDA-7/IL-24的生長曲線

2.2 單因素分析誘導表達條件

2.2.1 誘導時間對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 首先考察了不同誘導時間對CSP-MDA-7/IL-24融合基因表達的影響。結果見圖2，隨著誘導時間的增加，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達量也在逐漸增加，在加入IPTG誘導4 h后，重組蛋白表達量達到高峰，占菌體總蛋白的49.5%。但隨著誘導時間的增加，雜蛋白也在不斷增加，所以4 h為誘導最佳時間。

圖2 不同誘導時間重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達蛋白的SDS-PAGE

2.2.2 培養基pH值對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 對培養基不同pH值的考察結果見圖3，在其他誘導條件相同的情況下，培養基pH值為6～8時適宜CSP-MDA-7/IL-24表達，pH值為7.0時目的蛋白表達達高峰，占菌體總蛋白的89.6%。

圖3 培養基不同pH值時重組菌

2.2.3 誘導溫度對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 誘導溫度對CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達有很大影響。如圖4所示，在其他誘導條件相同的情況下，培養溫度為42℃時，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達含量占菌體總蛋白的54%，均高于其他溫度。

圖4 不同誘導溫度時重組菌

2.2.4 誘導劑IPTG濃度對CSP-MDA-7/IL-24表達的影響 誘導劑IPTG通過誘導pET原核表達載體中的lacUV5啟動子來過量表達T7RNA聚合酶，從而增加目的蛋白的表達。IPTG濃度對CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達的影響如圖5所示，在其他誘導條件相同的情況下，IPTG濃度為0.12 mmol/L時，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達含量占菌體總蛋白的25.2%。

圖5 不同IPTG濃度時重組菌

2.3 正交試驗優化表達條件

正交設計是一種快速、高效、經濟，能夠研究多因素不同水平的試驗設計方法。通過正交試驗分析影響重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達外源蛋白的主要因素，能夠提高目的蛋白的表達量。通過正交試驗L25（45）對誘導時間、培養基pH值、誘導溫度和誘導劑IPTG濃度共四因素五水平進行優化（參數水平見表1）。圖6為正交試驗不同條件下目的蛋白的表達結果，正交分析軟件分析四因素五水平對蛋白表達量的影響如表2（正交試驗結果與分析）、表3（方差分析）。結果表明，誘導溫度是CSP-MDA-7/IL-24表達的主要影響因素，具有顯著性差異；誘導時間、培養基pH值和誘導劑IPTG濃度對蛋白表達的影響較小，無顯著差異。綜合分析，42℃誘導4 h，培養基pH值為7.0，IPTG濃度為0.12 mmol/L，是CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達的最佳條件。背景清楚等優點的原核表達系統進行表達[11-13]。原核系統表達時，不同誘導條件在很大程度上影響目的蛋白的表達量[14-17]。本實驗中，融合基因CSP-MDA-7/IL-24在大腸桿菌BL21/pET21b表達

表1 正交實驗選取因素及其水平

圖6 SDS-PAGE分析正交試驗各條件下目的蛋白的表達量

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗軟件方差分析各因素對目的蛋白表達量的影響

3 討論

蛋白質藥物憑借其活性高、特異性強、毒性低、生物功能明確和有利于臨床應用等特點，已經成為醫藥領域的重要組成部分。重組蛋白可通過原核表達系統、昆蟲表達系統和酵母系統等進行表達。在本實驗中，我們利用DNA重組技術構建融合基因CSP-MDA-7/IL-24，選取具有易于培養、繁殖快、表達量高、成本低、易純化和遺傳載體中被誘導表達，蛋白產物以包涵體的形式存在，有利于目的蛋白的進一步提純。

研究表明，細菌生長速率對外源蛋白表達有很大影響。為提高目的蛋白表達效率，我們通過測定重組菌株的生長曲線，確定最佳誘導時機。單因素分析確定最適培養基pH值、最佳誘導溫度、最佳誘導時間和最適誘導劑IPTG濃度，并在此基礎上各選取5個水平進行正交試驗，摸索出最佳誘導表達條件。單因素分析結果表明，在最佳誘導時機，隨著誘導時間不斷增加，目的蛋白表達量也在不斷增加，誘導4 h時達到濃度高峰。在相同誘導時間下，SDS-PAGE結果分析表明，培養基pH為7.0、誘導溫度42℃、不同IPTG濃度下表達量相當。正交試驗SDS-PAGE結果表明，CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達最佳條件組合為誘導4 h、pH7.0、誘導溫度42℃、IPTG濃度0.12 mmol/L，此時目的蛋白表達量最高，達43.6%。正交分析結果表明，四因素五水平中，誘導溫度對重組蛋白表達具有顯著性影響，而pH值、溫度和IPTG濃度則無明顯影響。

本研究確定了重組蛋白肝靶向肽-抗腫瘤肽的最佳表達條件，為深入探討其復性條件、純化條件、生物學活性及藥物開發等提供了更多實驗依據。