外周血循環(huán)hTERT mRNA和CK19 mRNA的表達與鼻咽癌腫瘤微轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究*

付新灑,曹彥洋，李冠雪，陳 芳，王曉琪， 楊夢雪，蔡智謀，鐘慶雯，文 忠，申聰香△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，廣州 510282；2.中國人民解放軍第四一一醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200081；3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院小兒耳鼻咽喉科，廣州 510282)

鼻咽癌屬于上皮源性低分化或未分化惡性腫瘤，盡管近年在診斷和治療上均取得了較大進展，但綜合預(yù)后仍然很差，其總體5年生存率小于50%[1]，致死的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。外周循環(huán)血腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的前提，目前臨床上缺乏敏感又特異度高的液體活檢手段。近年研究表明，腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段,就可能有腫瘤細(xì)胞侵入外周循環(huán)血中[2]，而進入外周循環(huán)血液的腫瘤細(xì)胞仍可表達多種腫瘤特異性蛋白并釋放入循環(huán)血中。國內(nèi)外已有許多學(xué)者報道用實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)的方法檢測出腫瘤患者外周血微量癌細(xì)胞,它通過擴增能在腫瘤細(xì)胞中特異性表達而在其他血液細(xì)胞中不表達的特異性mRNA，從而實現(xiàn)在外周循環(huán)血中檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)及其游離mRNA。這種方法已經(jīng)應(yīng)用于肺癌、前列腺癌等血液腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移的研究[3-4]。上述研究提示，實時檢測循環(huán)血中CTCs及其釋放循環(huán)血中的特異性游離mRNA對判斷腫瘤早期微轉(zhuǎn)移及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。而與腫瘤有密切關(guān)系的端粒酶及其人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)亞單位成為理想的檢測指標(biāo)。本研究通過qRT-PCR法檢測鼻咽癌腫瘤患者外周循環(huán)血hTERT mRNA 表達情況并聯(lián)合檢測上皮性腫瘤標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白19(CK19) mRNA，分析二者在鼻咽癌患者外周循環(huán)血中的表達意義及與腫瘤細(xì)胞血液微轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 鼻咽癌組納入2013年9月至2014年6月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者，共44例，年齡23～72歲，平均49歲。患者均經(jīng)病理學(xué)確診為低分化型鱗狀細(xì)胞癌且既往未經(jīng)任何治療。TNM分期采用鼻咽癌2008臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例；T1期患者11例，T2期13例，T3期14例，T4期6例；N05例，N16例，N224例，N39例；M039例，M15例。同時，收集健康體檢者外周血標(biāo)本20例作為對照組。本研究通過了南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，病理標(biāo)本的采集和檢測試驗均經(jīng)患者知情同意。

1.1.2主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液(天津TB公司)，TRIZOL(美國Invitrogen公司)，PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(日本Takara公司)，ABI7500 熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1血標(biāo)本處理 鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者直接行放療，Ⅲ、Ⅳ期行兩個療程誘導(dǎo)化療后再行放療，治療前及放療結(jié)束后于上午6:00～9:00點采集外周靜脈血，采血時第1管血棄之不用，取第2管血5 mL置入真空無菌肝素抗凝的試管。2 h內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)離心2 500 r/min，20 min 后收集界面細(xì)胞，得到單個核細(xì)胞層(癌細(xì)胞在此層)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，置-80 ℃保存。對照組血標(biāo)本處理同鼻咽癌組。

1.2.2引物序列 內(nèi)參β-action引物及CK19 mRNA及hTERT引物采用Primer express設(shè)計，引物序列如下。CK19：上游引物5′-TGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′，下游引物5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′；hTERT：上游引物5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′，下游引物5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′；β-action：上游引物5′-TGA CAC CTC ACC TCA CCC AC-3′， 下游引物5′-CAC TGT CTT CCG CAA GTT CAC-3′。引物由上海生工公司合成。

1.2.3qRT-PCR 300 μL單個核細(xì)胞加入1 000 μL Trizol試劑進行RNA提取，用紫外分光光度計檢測總RNA水平，A260/A2801.8～2.0視為抽提的RNA純度高，-80 ℃保存。分別取總RNA 1 μg，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以反應(yīng)所得cDNA 進行PCR 擴增。反應(yīng)體系：SYBR Premix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和滅菌去離子水7.8 μL共20.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)：95 ℃變性15 s；60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，40個循環(huán)。以β-action作為內(nèi)參照，試驗重復(fù)3次。

1.2.4結(jié)果判斷 qRT-PCR由熒光定量PCR儀自動采集目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，基因表達量用鼻咽癌組/對照組(2-△△Ct)計算。

2 結(jié) 果

2.1兩組hTERT mRNA 和CK19 mRNA比較 試驗結(jié)果顯示，對照組外周血中CK19 mRNA相對表達量為0.85±0.50，鼻咽癌患者外周血中CK19 mRNA水平為10.97±4.60，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-14.39,P<0.01)。對照組外周血中hTERT mRNA相對表達量為1.09±0.40，鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA水平為10.45±3.81，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-16.64,P<0.01)，見圖1～2。

2.2hTERT mRNA 和CK19 mRNA與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系 鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA和CK19 mRNA的表達與臨床分期、T分期、N分期、M分期有明顯相關(guān)性(P<0.05),見表1。

圖1 hTERT mRNA 在鼻咽癌和對照組的相對表達量

圖2 CK19 mRNA 在鼻咽癌和對照組的相對表達量

項目nCK19 mRNAF/tPhTERT mRNAF/tP臨床分期20.24<0.0131.73<0.01 Ⅰ53.88±1.204.38±1.43 Ⅱ67.03±0.617.05±1.29 Ⅲ1911.27±2.5711.19±1.84 Ⅳ1414.78±4.2514.03±2.87N分期18.59<0.0126.64<0.01 N053.88±1.204.38±1.43 N167.03±0.617.05±1.29 N22412.08±3.8911.73±2.15 N3914.97±4.6014.18±3.30T分期12.26<0.019.24<0.01 T1116.85±3.187.72±3.75 T21310.24±3.529.72±3.03 T31412.42±3.1312.30±2.05 T4616.88±4.3014.70±3.55M分期4.590.038-3.700.020 M03910.46±4.1410.38±3.87 M1514.96±6.5013.64±1.40

2.3hTERT mRNA和 CK19 mRNA與鼻咽癌治療療效的關(guān)系 Ⅰ、Ⅱ期共11例患者直接行放療，Ⅲ、Ⅳ期共33例患者行兩個療程誘導(dǎo)化療后再行放療。治療后CK19 mRNA 由10.97±4.60降低至5.63±1.91；hTERT mRNA由10.75±3.81降為5.46±2.00。治療后CK19 mRNA和 hTERT mRNA表達量均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

腫瘤血行微轉(zhuǎn)移是近年的研究熱點，血行轉(zhuǎn)移也是鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，早期發(fā)現(xiàn)外周血腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移可篩選出具有轉(zhuǎn)移傾向的高危腫瘤患者，對于預(yù)測腫瘤外周血微轉(zhuǎn)移及臨床治療方案的選擇和預(yù)后的判斷具有重要意義。

細(xì)胞角蛋白(CK)表達于正常上皮和上皮源性腫瘤。正常情況下，血液中不存在CK，如果外周血中檢測出CK，提示上皮源性腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移入血。CK19 是國內(nèi)外公認(rèn)的的上皮性組織特異性標(biāo)志物，已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等上皮性腫瘤外周血中微轉(zhuǎn)移的檢測，有很高的靈敏度和較好的特異度[5-10]。hTERT是端粒酶催化亞基，與端粒酶一樣僅在腫瘤細(xì)胞中高表達，在對照組織中不表達，研究提示，hTERT與鼻咽癌關(guān)系密切，是癌變的早期事件[11-12]。因為端粒酶系統(tǒng)與惡性腫瘤的特異性關(guān)系，采用檢測腫瘤患者外周循環(huán)血中hTERT mRNA成為腫瘤患者血液活檢的重要方法，對于判斷血液微量CTCs存在的微轉(zhuǎn)移提供了重要線索，已顯示出有前景的臨床利用價值[13]。

本研究采用qRT-PCR技術(shù)檢測鼻咽癌患者外周血中CK19 mRNA和hTERT mRNA的表達，分子生物學(xué)水平預(yù)示血液中可能存在的微量CTCs及釋放的特異性腫瘤標(biāo)志物，對早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌外周血微轉(zhuǎn)移提供試驗依據(jù)，這有可能徹底改變目前臨床主要依靠影像學(xué)、病理學(xué)檢測腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的局限性、滯后性，有助于早期發(fā)現(xiàn)血液轉(zhuǎn)移高危患者。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，CK19 mRNA 和hTERT mRNA的表達較未轉(zhuǎn)移者明顯升高。這也證實了本課題組對于腫瘤微轉(zhuǎn)移是腫瘤真正轉(zhuǎn)移發(fā)生的前奏的猜測。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者外周血CK19 mRNA和hTERT mRNA的表達與臨床分期、T分期、N分期有相關(guān)性。即使是早期鼻咽癌患者，也可見CK19 mRNA和hTERT mRNA升高，說明鼻咽癌患者在癌癥的早期就可能在外周血出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞并進一步形成微轉(zhuǎn)移,且隨著臨床分期的進展而更趨明顯,與文獻[5,7]報道一致。因而，外周血hTERT及CK19 mRNA檢測亦對指導(dǎo)臨床治療有很大幫助。

但也有文獻報道，并非發(fā)現(xiàn)外周CTCs就說明出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，可能由于外周循環(huán)中腫瘤細(xì)胞受機體免疫系統(tǒng)的限制，絕大多腫瘤細(xì)胞并不能形成轉(zhuǎn)移灶，但是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移率卻明顯上升[5,7]。也有能在腫瘤微轉(zhuǎn)移發(fā)生中，必須達到一定的量變才會出現(xiàn)腫瘤真正遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的質(zhì)變。其機制有待于深入研究。

目前評判鼻咽癌的治療效果方面尚缺乏有效的臨床檢測指標(biāo)，外周血CK19mRNA和hTERT mRNA檢測在評判惡性腫瘤的治療效果方面顯示出了潛在的重要價值。GEORGOULIAS等[6]研究顯示，乳腺癌外周血CTCs中CK19 mRNA的陽性率經(jīng)過3個療程化療后由66.8%降低至47.8%，6個療程化療后，陽性率降低至44.3%。本研究的試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，治療后CK19 mRNA 由10.97±4.60降低至5.63±1.91；hTERT mRNA由10.75±3.81降為5.46±2.00，治療后CK19 mRNA和hTERT mRNA表達量均明顯下降。二者有可能成為鼻咽癌早期血液轉(zhuǎn)移及治療效果評估的標(biāo)志物。

綜上所述，通過外周血 CK19 mRNA和hTERT mRNA的檢測可能對傳統(tǒng)的鼻咽癌TNM分期進行補充以在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移，更有效地指導(dǎo)臨床治療。本研究結(jié)果已初步顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者CK19 mRNA 和hTERT mRNA的表達較未轉(zhuǎn)移者明顯升高。因此，有必要進行大樣本量的前瞻性對照研究，以闡明其與鼻咽癌微轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為鼻咽癌的診治提供新的參考指標(biāo)。