青蒿琥酯逆轉人卵巢癌3AO細胞所致T淋巴細胞的免疫抑制研究

陳 曉，高英芳，張志敏，張雪玲，王 巖，郝紅娟

(河北省石家莊市第四醫院婦產科 050011)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，確診時多數已至晚期，預后較差。目前，臨床多采用手術切除及術后化療方法治療，但80%患者會出現復發和病灶轉移[1]。醫學界對卵巢癌的發病機制進行了深入的研究，發現卵巢癌細胞分泌的多種免疫因子異常超表達，從而使機體處于免疫抑制狀態，并導致腫瘤細胞的“免疫逃逸”[1]。隨著腫瘤免疫學的廣泛研究，腫瘤免疫生物學治療已經成為腫瘤治療的新型輔助治療模式，具體包括抗體免疫導向療法、接種腫瘤疫苗的特異性主動免疫療法、癌基因表達封閉及抑癌基因恢復的基因療法、腫瘤血管生成拮抗方法、表觀遺傳修飾等[2]。然而，上述幾種腫瘤免疫療法多處于試驗研究階段，缺點為作用靶點單一，且毒副反應較明顯?？沽鲋兴幹苿┚哂卸喟悬c的優點，不僅可明顯干擾腫瘤細胞的增殖，上調機體免疫功能，還可增強放化療敏感性、降低毒副反應[3]。本課題組前期的試驗結果顯示，砷劑、黃芪、川芎嗪、豬苓多糖、苦參堿和青蒿素衍生物等可有效逆轉結直腸癌所致免疫抑制，彌補放化療和腫瘤生物制劑在臨床使用中的不足[4]。其中，青蒿琥酯(ART)可抑制自然殺傷細胞(NK)殺傷抑制及結直腸癌細胞株Colon26所致的CD3ε-ζ+表達抑制，但其在卵巢癌免疫抑制中的作用鮮見相關報道。本研究旨在原有報道的基礎上，體外試驗研究ART對卵巢癌所致T細胞免疫抑制的影響，以進一步驗證ART具有逆轉腫瘤免疫抑制的作用，為解決卵巢癌治療中的瓶頸難題提供新思路和新依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料 人卵巢癌3AO細胞為河北醫科大學基礎醫學院免疫教研室宋淑霞教授惠贈。外周血取自健康的女性志愿者(共20名)，年齡17～22歲，平均(19.33±1.45)歲，所有志愿者均已知情同意，本研究操作均遵循石家莊市第四醫院科學研究規范。

1.1.2主要試劑 DMEM購自北京海克隆生物化學制品有限公司；標準胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技責任有限公司；植物血凝素(PHA)、噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；二甲亞砜(DMSO)購自天津市永大化學試劑開發中心；淋巴細胞分離液購自上海恒信化學試劑有限公司；青蒿琥酯粉劑購自桂林南藥股份有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人CD3ε單抗(CD3-FITC)及CD4單抗(CD4-PE)、藻紅蛋白(PE)標記的小鼠抗人CD25(IL-2Rα)單抗(CD25-PE)及CD247(CD3ζ鏈)單抗(CD247-PE)購自美國eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1試驗分組 按照細胞培養上清液進行分組。完全培養基組為正常對照(Con)組，不含及含ART的完全培養基組分別為Con-S組和ART-S組，連續兩次ART再培養組為ART-S1組及ART-S2組，不經ART作用的同步兩次再培養組為Con-S1組及Con-S2組。

1.2.2人外周血單個核細胞(PBMC)的制備 抽取健康女性志愿者外周血15～20 mL入抗凝管， Hank′s液1.5倍稀釋，淋巴細胞分離液沿管壁緩慢加入(淋巴細胞分離液與稀釋前血液等體積)，保持清晰的分層狀態。2 000 r/min離心20 min后吸取液體界PBMC層入新離心管， Hank′s液輕柔清洗，加完全培養液制備細胞懸液。

1.2.3MTT法檢測 0.25%胰蛋白酶消化處于對數增長期的3AO細胞，完全培養基重懸至2×108/L，接種于96孔板48 h。細胞培養結束前4 h，每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL。細胞培養結束后離心棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，酶聯免疫檢測儀檢測A492 nm值。

1.2.4ART作用及作用后再培養的3AO細胞培養上清液的制備 0.25%胰蛋白酶消化對數生長期3AO細胞，分別用不含和含ART的完全培養基重懸至2×108/L，使ART的終濃度為12.50 mg/L。預試驗已證明12.50 mg/L的ART對3AO細胞增殖無明顯影響。培養48 h后收集不含及含ART作用的細胞培養上清液(Con-S組和ART-S組)。徹底清洗掉殘余藥物，重懸細胞至初始接種濃度，收集連續兩次ART再培養上清液(ART-S1及ART-S2)，以不經ART作用的同步再培養上清液(Con-S1組及Con-S2組)作對照。臺盼藍染色法進行活細胞計數，MTT法進行細胞增殖率檢測(A492 nm值)，細胞培養上清液-70 ℃凍存。

1.2.5ART對T淋巴細胞表面活化信號分子表達的影響 參考文獻[5]報道，培養瓶中分別加入0.25 mL 的PBMC(1×107/mL)和PHA(20 mg/L)及0.5 mL的待測上清液，以完全培養基為正常對照(Con組)。培養48 h后消化、重懸細胞，并取1×106個細胞分別加入CD4-FITC及CD25-PE或CD3-FITC及CD247-PE單抗各20 μL，室溫避光孵育20 min。離心棄上清液后懸浮細胞，流式細胞儀檢測CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+陽性細胞表達百分率，表達抑制率(%)=[(Con組陽性細胞表達百分率-Con-S和ART-S各組陽性細胞表達百分率)/Con組陽性細胞表達百分率]×100%。相同熒光素標記的人Isotype IgG作為陰性對照。

2 結 果

2.1試驗用ART濃度的確定 添加不同濃度的ART作用于3AO細胞，MTT檢測結果顯示，最高濃度為12.50 mg/L的ART對3AO細胞增殖與Con組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1A。ART-S和Con-S組的培養基作用3AO細胞48 h及作用后連續兩次再培養3AO細胞，MTT法結果顯示，與未經ART作用同步培養的3AO細胞相比，12.50 mg/L的ART未明顯影響細胞增殖(P>0.05)，見圖1B。本課題組考察了Con組、Con-S組和Con-S1組、 Con-S2組對PMBC增殖的影響，MTT檢測結果顯示，各組的A492 nm值分別為0.28±0.03、0.29±0.06、0.29±0.05和0.28±0.04，差異無統計學意義(P>0.05)。

A:不同濃度的ART細胞的A492 nm值；B：各組細胞的A492 nm值

圖1 MTT法檢測結果

2.2ART對3AO細胞所致T淋巴細胞表面活化信號分子表達抑制的影響 在Con組，淋巴細胞CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+陽性細胞百分率分別為(86.07±10.05)%、(25.09±5.84)%、(39.11±5.83)%。Con-S組、Con-S1組和Con-S2組中3項免疫功能指標均明顯受抑(P<0.05)。與Con-S組相比，ART-S組中T淋巴細胞表面CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+的表達抑制明顯下降(P<0.05)。ART-S1組對免疫功能抑制作用與Con-S1組相比均明顯降低(P<0.05)； ART-S2組對CD3ε+及IL-2Rα表達抑制的逆轉作用與Con-S2組相比明顯增加(P<0.05)，但是對CD3ε+ζ+的表達抑制無明顯逆轉作用(P>0.05)，見圖2。

2.3ART對T淋巴細胞表面活化信號分子表達抑制率的影響 在Con-S組中，CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+陽性細胞表達抑制率分別為(50.17±8.02)%、(87.51±9.17)%、(64.84±9.74)%。與Con-S組相比，ART-S組中CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+表達抑制率明顯降低(P<0.05)。與Con-S1組和Con-S2組相比，ART-S1組和ART-S2組對CD3ε+、IL-2Rα+的表達抑制率有明顯下調(P<0.05)，Con-S2組與ART-S2組中CD3ε+ζ+的表達抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

A:各組CD3ε+的陽性表達;B:各組CD3ε+ζ+的陽性表達;C:各組IL-2Rα+的陽性表達

圖2 ART對T淋巴細胞表面3種免疫功能指標表達的影響

A:各組CD3ε+的表達抑制率;B:各組CD3ε+ζ+的表達抑制率;C:各組IL-2Rα+的表達抑制率

圖3 ART對T淋巴細胞表面3種免疫功能指標的抑制效率

3 討 論

卵巢癌是嚴重危害女性身心健康的惡性腫瘤之一[6]。常規采用的手術切除和放化療治療后患者5年生存率不足30%[7]，手術及術后放化療多加重卵巢癌所致的免疫抑制。

患者被診斷為卵巢癌時多數已至癌癥晚期，此時腫瘤細胞已經跨過“免疫消除”和“免疫均衡”階段，進入到 “免疫逃逸”階段[8]。經典的手術及術后化療會進一步加重免疫抑制。因此，尋找具有腫瘤免疫抑制作用的逆轉類藥物成為腫瘤治療的關鍵所在，但此類藥物目前尚處于試驗階段，初步研究結果與目標療效尚有一定差距。

考慮到抗瘤中醫制劑具有清熱解毒、以毒攻毒、活血化瘀、化痰祛濕、軟堅散結、扶正祛邪的作用特點[5]，本課題組前期選取苦參堿和青蒿素衍生物(清熱解毒類)、砷劑(以毒攻毒類)、川芎嗪(活血化瘀類)、豬苓多糖(軟堅散結類)、黃芪(扶正祛邪類)6味中藥，研究其在直腸癌所致免疫抑制中的逆轉作用，結果顯示我國科學工作者自主研發的抗瘧藥ART對結直腸腫瘤免疫抑制的下調效應強而持久[9]。另有文獻報道，ART抑制人Tenon囊成纖維細胞和人肺腺癌細胞系A549的增殖[10-11]，并將乳腺癌細胞阻滯在G2/M期[12]，提示ART具有抑制腫瘤細胞增殖作用。與現有的抑瘤藥物相比，ART注射液制劑具有起效較快、作用較強，促進腫瘤細胞的分化和凋亡、調控腫瘤新生血管形成的作用[13]，但其對卵巢癌免疫抑制的影響尚未見報道。

CD3ζ鏈是一種受體激活的蛋白酪氨酸激酶底物，受體與配體的結合導致ζ鏈發生酪氨酸磷酸化，參與淋巴細胞胞內活化信號的轉導。CD3ε鏈基因缺陷可致T細胞信號傳導缺陷[14]。IL-2R分布于活化的T細胞、NK細胞和B細胞表面,其α鏈對形成高親和力受體有重要意義。考慮到上述3種免疫因子在免疫細胞信號轉導中的重要作用，本研究考察ART對其表達的調控作用。

腫瘤細胞自身分泌的免疫抑制物質可以引起腫瘤免疫抑制，且腫瘤細胞的分泌功能取決于自身的增殖活性。ART超過一定濃度范圍后可影響免疫細胞的增殖，在本研究中， 12.50 mg/L ART用3AO細胞48 h，及連續兩次48 h傳代培養的細胞，其A492 nm值與未經藥物作用同步對照培養的3AO之間差異無統計學意義(P>0.05)。單純的3AO細胞培養上清液對PBMC的增殖率的影響與完全培養基代替3AO細胞培養上清液的Con組相比也無明顯差異，說明單純的3AO細胞培養上清液對免疫細胞的增殖無影響。

本研究收集添加或不添加ART(12.50 mg/L)的3AO細胞培養上清液，各種培養上清液處理PBMC后檢測ART對3AO所致T淋巴細胞表面免疫因子的表達抑制是否具有逆轉作用。流式細胞術結果顯示，ART可明顯下調卵巢癌3AO細胞所致CD3ε+、CD3ε+ζ+和IL-2Rα+的表達抑制，但是不可以完全消除表達抑制，提示ART可以與其他抗瘤藥物組方以調整癌癥患者的免疫抑制。崔澂等[5]報道了ART明顯下調小鼠結直腸癌細胞Colon26所致NK細胞的殺傷抑制和脾細胞表面CD3ε+ζ+的表達抑制。本研究與崔澂的研究結果一致，提示ART可能通過降低癌細胞所致靶細胞表面免疫因子的表達抑制，進而激活免疫應答反應。卵巢癌細胞可以分泌多種免疫抑制因子，使機體處于免疫抑制狀態，是卵巢癌免疫抑制的機制之一[1]，本研究將在未來的工作中考察ART對卵巢癌細胞分泌免疫因子的影響，結合ART與其他抗瘤藥物聯合用藥對免疫抑制的逆轉作用，以期獲得逆轉卵巢癌免疫抑制的最佳方劑。

目前，腫瘤免疫抑制作用是制約手術、放化療及腫瘤生物治療的瓶頸性難題，其中關鍵的是腫瘤細胞所致T淋巴細胞免疫抑制[15]。因此，研發具有T淋巴細胞免疫抑制逆轉效應的新型多靶點抗瘤藥物已經成為醫學熱點。本研究通過體外卵巢癌細胞的免疫抑制試驗證明了ART對卵巢癌所致T淋巴細胞免疫抑制的下調有一定的逆轉作用，初步證明了ART具有抗瘤潛力，為考察ART的抗瘤機制提供了理論依據。