沉默DNA-PKcs對肝癌耐藥細胞Bel7402/5-Fu凋亡的影響*

李大玉，余春波，朱欣婷，劉喜平，范 芳，李長福

(遵義醫學院生化教研室，貴州遵義 563000)

原發性肝癌(HCC)是臨床常見的消化系統惡性腫瘤之一，臨床治療主要是包括手術、放療、化療、介入治療等的綜合治療，其中化療對HCC的治療有著重要作用，但化療過程中形成的多藥耐藥(MDR)是導致化療失敗的重要原因之一[1]。DNA依賴蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)是DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)的催化亞單位，在細胞內有許多重要的功能和作用，包括細胞凋亡信號傳導[2]、免疫細胞分化、基因重組性監視等。前期研究顯示，當沉默DNA-PKcs表達后Bel7402/5-Fu細胞P-糖蛋白(P-gp)表達下調，同時化療敏感性增加[3]。ZHANG等[4]研究結果顯示，當沉默神經膠質瘤細胞DNA-PKcs后，其化療敏感性增加，提示DNA-PKcs對腫瘤耐藥有一定關系，但其影響肝癌耐藥的功能及機制還未清楚。本研究以siDNA-PKcs轉染Bel7402/5-Fu肝癌耐藥細胞，檢測DNA-PKcs沉默后對肝癌耐藥細胞Bel7402/5-Fu的凋亡及其機制的影響，探討DNA-PKcs影響肝癌耐藥的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 Bel7402/5-Fu細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司；小干涉RNA(siRNA)寡核苷酸購自上海吉瑪基因生物技術有限公司；LipofectmineTM2000購自Invitrogen公司；Hoechst33342染色液購自上海碧云天生物技術公司；Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司；小鼠抗B細胞淋巴瘤-2相關x蛋白(Bax)、小鼠抗B細胞淋巴瘤/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)、抗體購自美國Proteintech公司；兔抗DNA-PKcs抗體購自美國Assay biotech公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將Bel7402和Bel7402/5-Fu細胞培養在含10%的胎牛血清的1640培養液中，置于37 ℃、5%的二氧化碳孵箱中培養，觀察細胞生長情況，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2分組與轉染 實驗分為空白對照組、脂質體對照組、陰性siRNA對照組(NC對照組)、siDNA-PKcs(針對DNA-PKcs基因轉錄水平表達的siRNA)實驗組。取對數生長期細胞種于培養板中，96孔板按(8～10)×103/孔接種細胞，6孔板按(6～8)×105/孔接種細胞，分組培養，當融合度為70%～90%時進行轉染，配制siDNA-PKcs-脂質體復合體，并加入對應孔中，培養箱內培養5 h后換液。

1.2.3Bel7402/5-Fu細胞耐藥性檢測 培養Bel7402和Bel7402/5-Fu細胞，分別接種96孔板，按1×104/孔加入其中，培養12 h，在對應孔內分別加入濃度為0、10、20、40、80、160、320、640 mg/L的5-氟尿嘧啶(5-Fu)，細胞在培養箱中再孵育48 h后，棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，然后每孔加入無血清-無抗生素培養基180 μL和20 μL噻唑藍(MTT),培養箱內再孵育4 h后，小心吸掉上層液(切勿吸掉底部結晶)，每孔加二甲基壓砜(MDSO)150 μL，振蕩30 s使結晶全部溶解后，490 nm波長測定其吸光度值(A值)，并計算半數抑制劑量(IC50)值及Bel7402/5-Fu細胞的耐藥指數(耐藥細胞IC50/親本細胞IC50)。

1.2.4Hoechst33342染色法檢測細胞形態學變化 將Bel7402/5-Fu細胞接種于6孔板中，12 h后轉染，用含200 mg/L 5-Fu的培養基進行培養，48 h后處理細胞，Hoechst33342染色(按試劑盒說明書操作)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將Bel7402/5-Fu細胞接種于6孔板，12 h后轉染，用含200 mg/L 5-Fu的培養基進行培養，48 h后收集細胞，PBS洗細胞兩次，用 Annexin V-EGFP/PI 雙染(按試劑盒說明書操作)， 1 h內流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測DNA-PKcs、Bax、Bcl-xl蛋白表達情況 提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)檢測定量樣品蛋白水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉膜，5%牛血清清蛋白封閉1 h，分別加入小鼠抗Bax抗體(1∶1 000)、小鼠抗Bcl-xl抗體(1∶1 000)和兔抗DNA-PKcs抗體(1∶1 000)，孵育過夜(4 ℃)，Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)洗膜3次，10分鐘/次，分別加1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、HRP標記的山羊抗兔IgG室溫孵育2 h,TBST洗膜3次，10分鐘/次，電化學發光(ECL)發光顯色，ImageJ定量分析軟件分析灰度比。

1.2.7Real-time PCR檢測DNA-PKcs的mRNA表達情況 使用Trizol試劑提取RNA，使用寡聚(dT)18引物(0.5 μg/μL)以總體積為10 μL的RT試劑盒進行反轉錄，用cDNA和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ在熒光PCR儀上進行實時PCR,引物為序列如下。DNA-PKcs正向5′-GTG ACA AGG CAA CTG TAT GAG C-3′；反向5′-ACA CCG ACC ACA AAA ATC TCT T-3′。β-actin正向 5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′；反向5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′，通過公式2-△△Ct分析計算各基因的相對表達量。

2 結 果

2.1MTT檢測細胞耐藥性 結果顯示，耐藥細胞Bel7402/5-Fu的IC50值[(683.93±9.38)mg/L]比親本細胞Bel7402的IC50值[(52.09±6.46)mg/L]高，差異有統計學意義(P<0.01)。耐藥細胞Bel7402/5-Fu的耐藥指數為13.13。

a：P<0.01，與siDNA-PKcs實驗組比較。A：實時定量PCR檢測細胞DNA-PKcs mRNA水平；B：Western blot法檢測細胞DNA-PKcs的蛋白表達及蛋白水平的半定量分析

圖1 siDNA-PKcs對細胞DNA-PKcs mRNA及蛋白表達的影響

2.2siDNA-PKcs對肝癌耐藥細胞Bel7402/5-Fu DNA-PKcs的mRNA及蛋白表達的影響 當細胞Bel7402/5-Fu轉染siDNA-PKcs 后，各組細胞DNA-PKcs的mRNA表達水平及蛋白表達水平較其余組明顯下調(P<0.01)；空白對照組、脂質體對照組、NC對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.3Hoechst33342染色法檢測細胞形態學變化 細胞轉染siDNA-PKcs后細胞體積縮小，細胞核邊集，呈亮藍色；對照組細胞形態無明顯變化，細胞轉染siDNA-PKcs后出現凋亡現象，見圖2。

圖2 細胞凋亡形態學圖片(hoechst33342染色，×100)

2.4流式細胞技術檢測細胞凋亡 當細胞轉染siDNA-PKcs后，經流式細胞術檢測結果顯示siDNA-PKcs實驗組細胞凋亡率較其余組增加，差異有統計學意義(P<0.01);空白對照組、脂質體對照組、NC對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.01，與siDNA-PKcs實驗組比較。A:流式細胞術檢測細胞的凋亡；B：各組細胞凋亡的半定量分析

圖3 siDNA-PKcs影響細胞凋亡的流式分析

2.5Western blot檢測Bax、Bcl-xl蛋白表達情況當細胞轉染siDNA-PKcs后，檢測結果顯示siDNA-PKcs組Bax蛋白表達上調，Bcl-xl蛋白表達下調，與其余組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

a：P<0.01，與siDNA-PKcs實驗組比較

圖4 siDNA-PKcs影響Bax、Bcl-xl蛋白表達的分析(Western blot)

3 討 論

HCC是常見的惡性腫瘤之一，臨床主要采用以手術為主的聯合多種方法的綜合治療，其中化療對腫瘤的治療具有重要的意義，但化療過程中容易形成MDR而影響腫瘤的治療效果。腫瘤耐藥是一個多重因素綜合作用的復雜過程，如腫瘤細胞凋亡通路受阻[5]、DNA損傷修復能力增強等。DNA-PKcs是DNA-PK的催化亞單位,DNA-PKcs有很多磷酸化位點，可通過自身磷酸化或磷酸化下游分子參與細胞內的多種生物學活動，包括參與雙鏈斷裂的DNA修復[6-7]和細胞凋亡途徑的信號傳導等[8]。DNA-PKcs在不同的細胞活動中發揮了不同的生物學功能。

在胃癌細胞中，當抑制PARP1的活性時，增加了DDP誘導的DNA損傷和細胞凋亡，其機制是通過影響DNA-PKcs的穩定性，從而減少DNA損傷修復的能力，提高化療敏感性[9]。HU等[10]研究胰腺癌細胞發現，抑制細胞DNA-PKcs的表達會增加細胞的化療敏感性。當DNA-PKcs的功能缺失時，將引起A549細胞ATM的激活和p53的反應，進一步調控細胞周期[11]。DNA-PKcs具有調節細胞凋亡的功能[12]。ZOU等[13]報道發現，DNA-PKcs與Bcl-2呈正相關。當siRNA沉默人肝癌HepG2中DNA-PKcs表達后，激活Caspase-3和p53，同時下調Bcl-2和外源谷胱甘肽(GSH)的表達，通過抑制磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/核因子-kappaB(PI3K/Akt/NF-κB)途徑，促進順鉑(DDP)和5-Fu聯合應用引起的細胞凋亡及DNA損傷[14]。下調骨肉瘤細胞中DNA-PKcs表達后，以增進凋亡[15]和G1阻滯提高細胞對順鉑的敏感性[16]。以上研究結果提示DNA-PKcs可能通過對不同途徑或凋亡通路中的分子進行調控，從而影響不同腫瘤細胞的耐藥性。本實驗中，當HCC耐藥細胞Bel7402/5-Fu的DNA-PKcs表達沉默后，形態學檢測結果顯示，細胞體積縮小，染色質邊聚，呈亮藍色，這些形態學上的改變提示細胞出現凋亡現象。進一步用流式細胞術檢測凋亡，結果顯示凋亡率增加。同時，免疫印跡檢測Bax、Bcl-xl蛋白表達水平，結果顯示Bax蛋白表達水平增加、Bcl-xl蛋白表達水平減少，提示沉默DNA-PKcs的表達能促進HCC耐藥細胞Bel7402/5-Fu的細胞凋亡，增加化療敏感性。這說明DNA-PKcs可通過細胞某個凋亡途徑影響肝癌細胞的耐藥，其機制可能與siDNA-PKcs上調Bax蛋白表達水平和下調Bcl-xl蛋白表達水平有關，但具體的機制還需進一步的實驗研究。