GDNF基因治療對帕金森病小鼠TH陽性神經(jīng)元損害及胃腸功能障礙的影響*

吳少璞，祁亞偉，李 學(xué)，楊紅旗，馬建軍

(河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450002)

帕金森病(PD)是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，其臨床癥狀除了靜止性震顫、姿勢不穩(wěn)等運(yùn)動障礙以外，還表現(xiàn)為胃腸道功能障礙等非運(yùn)動障礙。PD主要是由于患者大腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變而導(dǎo)致的神經(jīng)元壞死和神經(jīng)功能受損。目前對于PD發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為PD是由于多巴胺含量下降引起的；其臨床治療以減輕臨床癥狀、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)為主[1]。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) 能修復(fù)退化的多巴胺神經(jīng)元，促進(jìn)黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的再生，是目前活性最強(qiáng)的神經(jīng)元保護(hù)因子[2]。目前關(guān)于GDNF與PD動物模型的研究主要有兩種，除了通過GDNF直接輸注，還有通過病毒為載體的基因改造療法或經(jīng)基因工程改造后再通過細(xì)胞介導(dǎo)輸注[3]。GDNF相對分子質(zhì)量大，難以透過血腦屏障，且必須通過持續(xù)性給予才能起到較好的神經(jīng)修復(fù)作用，直接輸注的效果不佳。本文通過GDNF基因療法研究其對PD小鼠模型的神經(jīng)修復(fù)作用和對胃腸功能的影響，為基因治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性 C57BL/6J小鼠60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[許可證編號SCXK(京)2006-0009]。(24±2)℃、(55±5)%相對濕度、12 h日夜循環(huán)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g。小鼠分為對照組(n=15)、實(shí)驗(yàn)組(n=30)和健康組(n=15)。

1.2方法

1.2.1GDNF慢病毒質(zhì)粒巨噬細(xì)胞特異性合成啟動子構(gòu)建 慢病毒載體的巨噬細(xì)胞特異性合成啟動子構(gòu)建參照BIJU等[4]報(bào)道，該序列包含兩個(gè)順式作用元件：CATT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和融合蛋白-1(AML-1)，采用CD68迷你啟動子代替質(zhì)粒中原來的p47phox的迷你基因啟動以提高特異性，然后用大鼠GDNF基因(Genbank編號：nm019139，STS 50-685)取代報(bào)告基因(GFP)。設(shè)計(jì)引物的上游引物為5′-CGG AAT TCG GTA CCG AGC TCT TAC GC-3，下游引物為5′-CGA CCG GTA CTG GGT GGC CTC CAG TG-3′； 使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR分子擴(kuò)增程序，PCR反應(yīng)條件為30 s 30次94 ℃，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。并對產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序，以驗(yàn)證插入位點(diǎn)，以及GDNF基因的完整性。獲得由慢病毒載體的293T細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的3個(gè)包裝質(zhì)粒(pmdlg/pMDlg-pRRE，pRSV Rev和PMD.G)構(gòu)成的慢病毒質(zhì)粒。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)與骨髓細(xì)胞移植[5]在骨髓注射前4 d給供體小鼠注射150 mg/kg氟尿嘧啶。用stempro-34-sfm完全培養(yǎng)基(Gibco公司)沖洗供體小鼠的股骨和脛骨骨髓獲得骨髓細(xì)胞，添加200 mmol/L谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，5 U/mL肝素制作單細(xì)胞懸液。使用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并采用密度梯度分離法分離，進(jìn)行體外過夜培養(yǎng)，第2天使用400 μL濃縮病毒上清液重懸獲得的細(xì)胞懸液。在含有RetroNectin蛋白(Takara)的圖層板上，4 μg/mL硫酸魚精蛋白存在下進(jìn)行6 h感染。感染后經(jīng)小鼠尾靜脈注射(1～2)×106細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組小鼠接受表達(dá)GDNF的慢病毒骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，對照組和健康組小鼠進(jìn)行等量滅菌生理鹽水注射。

1.2.3PD模型建立[6]移植后8周，給予對照組和觀察組小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP，美國Sigma公司)生理鹽水腹腔注射：第1天15 mg/kg,第2天25 mg/kg，第3～7天30 mg/kg。前兩天進(jìn)行低劑量注射是為了避免周圍毒性導(dǎo)致動物死亡。健康組在相同的方案下進(jìn)行生理鹽水腹腔注射。建立模型第7天對造模小鼠進(jìn)行PD行為學(xué)檢測，從對照組和觀察者中分別挑選12、24只造模成功的小鼠入組；健康組選取12只健康小鼠入組。在最后1次MPTP/生理鹽水注射1周后處死動物。

1.2.4觀察指標(biāo)

1.2.4.1RT-PCR檢測GDNF表達(dá) 分別于移植GDNF的慢病毒骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第1、3、5、8周從實(shí)驗(yàn)組挑選3只小鼠驗(yàn)證GNDF的表達(dá)：使用8%水合氯醛進(jìn)行麻醉，在麻醉成功后，向小鼠心臟注射肝素化冰生理鹽水，斷頭取腦。提取小鼠黑質(zhì)總RNA，提取方法為TRnzol試劑提取法，按照試劑盒(購自江萊生物)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR檢測，以β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平作為內(nèi)參，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置。預(yù)變性：94 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)：94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4.2行為學(xué)觀察 通過爬桿試驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒行為試驗(yàn)來評價(jià)小鼠的四肢運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。(1)爬桿試驗(yàn)：測試時(shí)間為MPTP注射第1、5、7天及最后1次注射后7 d；在0.5 m長(直徑0.8 cm)的木棍一側(cè)固定直徑0.25 m的軟木球，木桿上纏繞紗布，記錄小鼠從軟木球上出發(fā)走完整個(gè)木棍的時(shí)間，即爬桿時(shí)間。(2)轉(zhuǎn)棒行為學(xué)檢測：測試時(shí)間為注射第7天及最后1次注射后7 d，提前3 d開始使用轉(zhuǎn)棒行為學(xué)儀器訓(xùn)練3組動物，每天轉(zhuǎn)速12 r/min，訓(xùn)練5 min，測試時(shí)記錄3組小鼠在20 r/min轉(zhuǎn)速下的棒上停留時(shí)間。

1.2.4.3黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽性(Tyrosine hydroxylase+,TH+)多巴胺能神經(jīng)神經(jīng)元數(shù)目 于最后1次注射MPTP/生理鹽水后第7天，使用8%水合氯醛進(jìn)行麻醉，在麻醉成功后，向小鼠心臟注射肝素化冰生理鹽水，斷頭取腦。于冰上進(jìn)行小鼠腦組織冠狀切片，厚度約為1 mm，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，詳細(xì)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，試劑盒由江萊生物提供。同時(shí)采用光學(xué)分流法對3組小鼠腦組織中的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4.4體質(zhì)量變化 MPTP具有全身毒性作用，會導(dǎo)致小鼠發(fā)生營養(yǎng)障礙，體質(zhì)量下降。分別在皮下注射前1天，注射第1天，注射第7天，最后1次注射后第7天對3組小鼠進(jìn)行稱重，比較3組動物的體質(zhì)量變化。

1.2.4.5胃腸道功能 配置淀粉糊：向125 mL蒸餾水中添加5.0 g羧甲基纖維素鈉，8.0 g奶粉，4.0 g蔗糖，4.0 g淀粉，1.5 g活性炭末，攪拌配置成均勻的糊狀物。所有小鼠在最后一次注射MPTP/生理鹽水后第7天處死前18 h進(jìn)行禁食，然后進(jìn)行淀粉糊灌胃，灌胃劑量0.025 mL/g，灌胃后20 min處死小鼠，結(jié)扎幽門和賁門，分離胃和小腸，稱胃的質(zhì)量，質(zhì)量記為M；對胃進(jìn)行解剖除去內(nèi)容物生理鹽水沖洗晾干，再次稱重，記為m。同時(shí)平鋪小腸，測量幽門至盲腸的長度L1、幽門至小腸中淀粉糊處的長度L2。胃排空率=[1-(M-m)/灌胃質(zhì)量]×100%；小腸推進(jìn)率=L2/L1×100%。

2 結(jié) 果

2.1腦組織中GDNF在mRNA水平的表達(dá) 在移植GDNF的慢病毒骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，GDNF在小鼠腦組織中成功表達(dá)，并且從第1周到第8周小鼠腦組織中GDNF的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中GDNF的表達(dá)

2.2行為學(xué)觀察 注射MPTP/生理鹽水造模第1、7天，以及最后1次注射后7 d，3組小鼠爬桿時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠爬桿時(shí)間明顯長于健康組且短于對照組(P<0.05)。注射MPTP/生理鹽水造模第7天，以及最后1次注射后7 d，3組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠停留時(shí)間明顯短于健康組且長于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 3組小鼠爬桿時(shí)間和轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與健康組比較

表2 3組小鼠體質(zhì)量變化比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與健康組比較

2.3TH+多巴胺能神經(jīng)神經(jīng)元數(shù)目 對照組、實(shí)驗(yàn)組和健康組小鼠的TH+多巴胺能神經(jīng)神經(jīng)元數(shù)目分別為：(8 610.26±833.64)、(1 117.54±1 037.18)、(1 369.87±1 440.16)×10-4/μm3。3組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠黑質(zhì)中的TH+多巴胺神經(jīng)元纖維比對照組更密，顏色更深；實(shí)驗(yàn)組小鼠黑質(zhì)中的TH+巴胺神經(jīng)元纖維比健康組更疏，顏色更淺，見圖2。

A:健康組；B:對照組；C:實(shí)驗(yàn)組

圖2 3組小鼠黑質(zhì)中TH+多巴胺神經(jīng)元染色結(jié)果(×20)

2.4體質(zhì)量變化 造模前1 d 3組小鼠體質(zhì)量無明顯差異；注射MPTP/生理鹽水第1、7天，以及最后1次注射后7 d時(shí)3組小鼠體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)組小鼠注射第7天及注射后7 d體質(zhì)量均明顯低于健康組且高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.5胃腸道功能 實(shí)驗(yàn)組小鼠的胃排空率、小腸推進(jìn)率均明顯低于健康組且高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 3組小鼠的胃排空率和腸推進(jìn)率比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與健康組比較

3 討 論

PD是因多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性變化而導(dǎo)致神經(jīng)退化壞死所致，其臨床特征主要為運(yùn)動障礙。此外，98%以上的患者還會出現(xiàn)非運(yùn)動障礙，其中胃腸道功能障礙是PD患者最明顯的非運(yùn)動障礙，發(fā)生率約為80%[7]。目前PD尚無根治之法，臨床治療以緩解患者癥狀為主，既不能恢復(fù)壞死的神經(jīng)元也不能很好地終止病理進(jìn)程。GDNF是目前公認(rèn)最佳神經(jīng)保護(hù)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化和再生長的功能[8]。但GDNF是一種大分子，直接注射難以透過血腦屏障，療效不佳。GDNF基因修飾是改善PD的最有效途徑，但目前尚處于動物實(shí)驗(yàn)摸索研究階段[9]。慢病毒載體介導(dǎo)通過基因重組構(gòu)建表達(dá)GDNF的慢病毒，再包裝、注射進(jìn)入體內(nèi)，免疫反應(yīng)小，安全性高[10]。本文通過慢病毒質(zhì)粒巨噬細(xì)胞獲得表達(dá)GDNF的慢病毒質(zhì)粒并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使得GDNF在小鼠腦組織中成功表達(dá)。

本文采用爬桿試驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)比較3組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)功能明顯優(yōu)于對照組并明顯弱于健康組，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)基因治療能有效改善PD小鼠的運(yùn)動障礙。PD發(fā)病的一個(gè)最重要原因是其腦內(nèi)黑質(zhì)中的多巴胺含量下降，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞受損。MPTP的體內(nèi)代謝產(chǎn)物能夠通過抑制多巴胺合成酶TH的活性來降低小鼠黑質(zhì)中多巴胺含量[11]；TH是多巴胺合成的限速酶[12]。本研究中實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)目明顯低于健康組且高于對照組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠黑質(zhì)中的TH+多巴胺神經(jīng)元纖維比對照組更密集，顏色更深，比健康組更疏，顏色更淺。說明GDNF基因移植后能明顯促進(jìn)小鼠腦組織中的神經(jīng)元細(xì)胞的再生，改善修復(fù)受損的神經(jīng)元。分析認(rèn)為通過基因工程改造后的骨髓干細(xì)胞經(jīng)過小鼠尾靜脈移植能夠跨過血腦屏障，與局部組織整合，并表達(dá)GDNF，進(jìn)一步通過絲裂原活化蛋白激酶-蛋白激酶C信號通路提高TH陽性表達(dá)[13]，提高多巴胺的合成，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，有助于神經(jīng)纖維修復(fù)[14]。段奎甲等[15]通過GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞并移植PD大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)GNDF基因修飾移植的大鼠較GFP基因移植的大鼠的多巴胺神經(jīng)元分化更多，其TH+陽性表達(dá)也明顯更高，該方法能夠明顯改善PD大鼠的運(yùn)動障礙，與本文研究結(jié)果類似。

除了典型的運(yùn)動障礙、神經(jīng)元損害外，PD患者胃腸道功能障礙的中最明顯的表現(xiàn)是胃排空延遲；胃腸道功能損害會進(jìn)一步引起體質(zhì)量下降，并且隨著病情發(fā)展，胃腸道功能障礙會隨之加重[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射MPTP第1天對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出明顯的體質(zhì)量下降，且對照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組；造模第7天及造模后第7天對照組小鼠體質(zhì)量無明顯變化，對照組和試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量明顯下降，且對照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠的胃排空率、小腸推進(jìn)率均明顯低于健康組且高于對照組，說明實(shí)驗(yàn)組小鼠的胃排空功能和腸道蠕動明顯優(yōu)于對照組但明顯弱于健康組，GDNF的基因治療能明顯改善PD小鼠的胃腸道功能障礙。研究認(rèn)為PD患者發(fā)生胃腸功能障礙的原因可能是腦組織中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變性退化，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的減少，對胃腸道蠕動的調(diào)控變?nèi)鮗17]。同時(shí)有學(xué)者報(bào)道PD大鼠體內(nèi)的胃腸道多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯低于健康大鼠[18]。分析認(rèn)為小鼠移植表達(dá)GDNF的巨噬細(xì)胞，能夠促進(jìn)腦組織中多巴胺合成，修復(fù)與胃腸道蠕動相關(guān)的受損神經(jīng)，改善PD小鼠的胃腸道功能障礙。

綜上所述，GDNF基因療法治療PD小鼠能夠明顯改善PD小鼠的運(yùn)動障礙，促進(jìn)腦組織中受損的TH陽性神經(jīng)元細(xì)胞再生，修復(fù)神經(jīng)纖維，提高胃腸道蠕動，改善胃腸道功能障礙。但是其具體機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。