基于生物信息學(xué)分析肺炎鏈球菌LytR蛋白特征*

吳凱峰， 張競(jìng)之，查 何，劉 雁，童華波，潘 衛(wèi)，王正蓉

(1.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 563000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004)

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見(jiàn)的細(xì)菌性病原菌，其所致的肺炎也是重癥社區(qū)獲得性肺炎入住重癥監(jiān)護(hù)室最常見(jiàn)的原因[1]。2013年，全球約有40萬(wàn)6歲以下兒童死于肺炎鏈球菌感染[2]。此外，全球也正面臨較為嚴(yán)峻的肺炎鏈球菌抗生素耐藥，以及7價(jià)或13價(jià)肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗在地區(qū)之間保護(hù)效果不一和保護(hù)率有限等問(wèn)題[3-4]。為切實(shí)提高對(duì)肺炎鏈球菌感染的防治能力，需要深入了解肺炎鏈球菌的分子致病基礎(chǔ)。

磷壁酸是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁重要的多糖分子。在肺炎鏈球菌中，磷壁酸也是一種極為重要的毒力因子[5-6]，該分子在感染過(guò)程中有著與其他細(xì)菌磷壁酸相似的生物學(xué)功能，且可能具有某些新特征。當(dāng)細(xì)菌磷壁酸顯著減少時(shí)，相應(yīng)的肺炎鏈球菌的生理學(xué)功能將嚴(yán)重受損，細(xì)菌致病力也將明顯降低[5]。由此可見(jiàn)，研究磷壁酸的合成過(guò)程對(duì)指導(dǎo)設(shè)計(jì)新型抗菌藥物或疫苗具有重要的理論價(jià)值。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RafX蛋白參與了磷壁酸的生物合成，體內(nèi)外研究顯示，RafX蛋白與肺炎鏈球菌毒力有密切關(guān)系，RafX基因缺陷的肺炎鏈球菌毒力明顯下降[7]。然而，肺炎鏈球菌磷壁酸并未因RafX蛋白的缺失而完全減少[7]，因此，本課題組猜測(cè)還存在替代途徑參與磷壁酸的合成。

肺炎鏈球菌存在一個(gè)名為L(zhǎng)ytR_cps_psr (LCP)蛋白家族，該家族蛋白被認(rèn)為與細(xì)菌胞外多糖共價(jià)連接至細(xì)胞壁肽聚糖有關(guān)[8-9]，該家族成員包括spr1759 (LytR)、Cps2A和Psr等。其中，LytR蛋白功能尚未完全清楚。閔迅等[10]前期已利用原核表達(dá)方式對(duì)肺炎鏈球菌LytR蛋白(肺炎鏈球菌R6菌株即spr1759)進(jìn)行過(guò)表達(dá)，晶體生長(zhǎng)及衍射分析，然而由于技術(shù)原因，尚未對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析和功能研究。因此，本研究試圖利用生物信息學(xué)方法，從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取肺炎鏈球R6標(biāo)準(zhǔn)菌株的spr1759基因及其編碼蛋白序列，分析其基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能特征等，為肺炎鏈球菌的LytR蛋白功能研究及細(xì)菌致病機(jī)制和防治策略研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1肺炎鏈球菌spr1759基因及其編碼氨基酸序列和生物信息學(xué)策略 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并下載肺炎鏈球菌R6標(biāo)準(zhǔn)菌株spr1759及其編碼全長(zhǎng)氨基酸序列(protein ID 為NP_359351.1)。本研究主要利用BioEdit Sequence Alignment Editor、TMHMM、ExPASy、Megalign等多種軟件對(duì)LytR進(jìn)行分析。所用在線工具的網(wǎng)址鏈接參見(jiàn)前期文獻(xiàn)報(bào)道[11]。

1.2方法

1.2.1肺炎鏈球菌LytR蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用Bioedit Sequence Alignment Editor軟件對(duì)spr1759蛋白氨基酸組成進(jìn)行分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Protein數(shù)據(jù)字庫(kù)搜索NP_359351.1獲得FASTA格式的全長(zhǎng)蛋白序列，使用Bioedit軟件打開(kāi)spr1759蛋白序列文件，點(diǎn)擊Sequence，找到Protein，再選擇Amino Acid Composition，獲得蛋白構(gòu)成信息。利用ProtParam預(yù)測(cè)相關(guān)spr1759蛋白原子組成、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。進(jìn)入ExPASy ProtParam網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Compute parameters，即可獲取相關(guān)參數(shù)，其中，GRAVY值為正，提示疏水性強(qiáng)；GRAVY為負(fù)，提示親水性強(qiáng)。此外，再利用ProtScale預(yù)測(cè)spr1759蛋白的疏水性/親水性，進(jìn)入ExPASy ProtScale網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，選擇Kyte & Doolittle，點(diǎn)擊Submit，獲得Kyte和Doolittle疏水分析信息，預(yù)測(cè)值為正，表明疏水性強(qiáng)；反之，負(fù)值表示親水性強(qiáng)。

1.2.2肺炎鏈球菌spr1759蛋白的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè) 分別利用Tmpred和TMHMM對(duì)spr1759蛋白進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。進(jìn)入ExPASy TMpred網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Run TMpred；進(jìn)入TMHMM Server V.2.0，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Submit，獲得跨膜螺旋結(jié)構(gòu)信息。利用SignalP預(yù)測(cè)其信號(hào)肽；進(jìn)入SignalIP 4.1 Server，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Submit，獲得信號(hào)肽信息。利用InterProScan和SMART對(duì)spr1759蛋白的功能域進(jìn)行分析。進(jìn)入EMBL-EBI InterPro網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Submit，獲得功能域信息；進(jìn)入SMART主頁(yè)，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Sequence SMART，獲得功能域信息。利用SOPMA和Predictprotein預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)長(zhǎng)spr1759蛋白的2級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)入SOPMA的2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊Submit，獲得α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲比例。進(jìn)入Predictprotein網(wǎng)站，輸入spr1759蛋白序列，點(diǎn)擊PredictProtein，登錄獲得二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。將來(lái)源不同細(xì)菌的序列輸入Megalign軟件進(jìn)行序列間比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1spr1759蛋白的理化特征 肺炎鏈球菌spr1759蛋白理論等電點(diǎn)為5.11，相對(duì)分子質(zhì)量為37.56×103，由338個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含31個(gè)Leu(9.2%)，30個(gè)Glu(8.9%)，30個(gè)Gly(8.9%)，29個(gè)Ile(8.6%)；該蛋白堿性氨基酸和酸性氨基酸總數(shù)分別為39個(gè)(11.5%)和45個(gè)(13.3%)(圖1A)。全長(zhǎng)spr1759蛋白氨基酸脂肪指數(shù)97.16，GRAVY值為-0.218，穩(wěn)定指數(shù)為44.95，屬于不穩(wěn)定蛋白。從圖1B可見(jiàn)，全長(zhǎng)spr1759蛋白肽鏈，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，第214位氨基酸殘基分值最低(-3.000)，第10位氨基酸殘基分值最高(2.700)。

2.2一級(jí)結(jié)構(gòu)中所含結(jié)構(gòu)和功能域特征序列分析 InterProScan分析結(jié)果顯示，spr1759蛋白僅含有1個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，屬于細(xì)胞壁相關(guān)轉(zhuǎn)錄衰減因子(圖2A)。另外，用NCBI網(wǎng)站分析軟件對(duì)全長(zhǎng)spr1759蛋白進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)S.pneumoniae spr1759蛋白屬于LytR_cpsA_psr超家族蛋白(圖2B)，其E值為1.24e-93，提示一種陰離子細(xì)胞壁多聚物合成相關(guān)酶的功能。SMART分析進(jìn)一步支持了上述分析結(jié)果，spr1759蛋白該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贚ytR_cps_psr結(jié)構(gòu)域。

A：spr1759氨基酸組成；B：Kyte和Doolittle疏水性分析

圖1肺炎鏈球菌spr1759蛋白氨基酸組成分布和疏水性

2.32級(jí)結(jié)構(gòu)特征 spr1759蛋白SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白α-螺旋占48.52%，β-折疊占17.16%，β-轉(zhuǎn)角占7.40%，無(wú)規(guī)則卷曲占26.92%。Predictprotein預(yù)測(cè)結(jié)果與SOPMA基本一致，從圖3A可見(jiàn)，α-螺旋和β-折疊散在分布蛋白中，作為整個(gè)蛋白的剛性支撐結(jié)構(gòu)，α-螺旋占31.95%，β-折疊13.91%；無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為蛋白的柔性區(qū)域，占54.14%。Tmpred預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)提示，該蛋白總分值大于0，最高值達(dá)2500，在氨基端具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖3B)。LytR蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，位于蛋白第24和第25位氨基酸之間，cut-off值為0.420(圖3C)，InterProScan分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SignalP和Tmpred的預(yù)測(cè)結(jié)果。利用TMHMM軟件對(duì)S.pneumoniae spr1759蛋白(圖3D)與LytR家族蛋白成員B.anthracis BAS5115(圖3E)和B.subtilis DJ97_1211(圖3F)進(jìn)行了2級(jí)結(jié)構(gòu)跨膜區(qū)域的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3者均含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(TM)和胞外結(jié)構(gòu)。

A：InterProScan預(yù)測(cè)肺炎鏈球菌R6 spr1759蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的保守功能域；B：NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2生物信息學(xué)分析肺炎鏈球菌spr1759的保守結(jié)構(gòu)域

A：以Predictprotein預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)；B：使用Tmpred預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；C：SignalP預(yù)測(cè)信號(hào)肽，利用TMHMM分析；D:Streptococcus pneumoniae spr1759跨膜結(jié)構(gòu)；E:Bacillus anthracis BAS5115跨膜結(jié)構(gòu)；F:Bacillus subtilis DJ97_1211跨膜結(jié)構(gòu)

圖3肺炎鏈球菌R6 LytR的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

2.4系列比對(duì) 為了進(jìn)一步明確肺炎鏈球菌spr1759蛋白的功能，本研究將其與LytR-Cps-Psr家族其他成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，Streptococcus pneumoniae LytRvs.Bacillus anthracis BAS5115,Streptococcus pneumoniae LytRvs.Bacillus subtilis DJ97_1211蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)spr1759與BAS5115和DJ97_1211序列相似性分別為35.7%和32.5%(圖4)，相似性超過(guò)30.0%。

圖4 LytR家族蛋白成員一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比

3 討 論

任何一種抗菌藥的使用總是會(huì)伴隨著耐藥菌的逐漸增加而失去功效，例如，我國(guó)肺炎鏈球菌臨床分離株對(duì)紅霉素幾乎全部耐藥[12]。因此，為能長(zhǎng)期有效控制細(xì)菌感染，人類需要不斷研發(fā)與原有抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性的新抗菌藥，這就需要不斷挖掘新的作用靶點(diǎn)。

LCP蛋白家族在很多陽(yáng)性細(xì)菌中具有重要作用，主要參與細(xì)胞壁合成[8,13]。通過(guò)系列分析本課題組發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌也存在類似蛋白，LytR蛋白就是其中之一。為了探究其可能的生物學(xué)功能，本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為37.56×103，具有跨膜結(jié)構(gòu)，脂溶性差，親水性好，這一預(yù)測(cè)結(jié)果與閔迅等[10]前期研究是吻合的。閔迅等利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有跨膜結(jié)構(gòu)(信號(hào)肽部分片段)無(wú)法實(shí)現(xiàn)蛋白游離表達(dá)，而將跨膜結(jié)構(gòu)(氨基端30氨基酸)去除后，成功實(shí)現(xiàn)了蛋白的可溶表達(dá)，一方面證實(shí)了該蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)，位于氨基端；另一方面也提示使用TMHMM和Tmpred等生物信息學(xué)軟件分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域是一種快速、簡(jiǎn)便和正確的方式。

使用InterProScan和SMART對(duì)LytR蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有Lcp蛋白家族功能結(jié)構(gòu)域，屬于細(xì)胞壁代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄衰減因子，然而從細(xì)胞定位分析和跨膜結(jié)果預(yù)測(cè)并不支持其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能，此外，EBERHARDT等[14]已經(jīng)利用GFP蛋白示蹤的方法顯示肺炎鏈球菌LytR蛋白(spr1759)位于細(xì)菌細(xì)胞膜，因此，該蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子的可能性較小。序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌LytR蛋白與炭疽桿菌的BAS5115二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，都含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)功能結(jié)構(gòu)域；二者一級(jí)結(jié)構(gòu)相似性超過(guò)30%，說(shuō)明二者具有較高的同源性。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，炭疽桿菌BAS5115具有酶學(xué)功能[15]，因此，本課題組認(rèn)為spr1759可能也具有酶學(xué)的功能。那么，肺炎鏈球菌spr1759蛋白功能究竟如何，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本課題組利用生物信息學(xué)對(duì)肺炎鏈球菌LytR蛋白的理化性質(zhì)，跨膜結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析，結(jié)果提示LytR蛋白可能參與肺炎鏈球菌細(xì)胞壁多糖的組裝連接過(guò)程。目前，通過(guò)抑制LytR蛋白發(fā)揮抗菌作用的藥物尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究提示LytR可能具有這一重要酶學(xué)功能，將為后續(xù)LytR蛋白的定位和功能實(shí)驗(yàn)室研究奠定基礎(chǔ)，也將為未來(lái)針對(duì)LytR蛋白靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)鋪墊。