循環microRNA-21水平在預測冠狀動脈側支循環形成中的作用*

廖清池，胡艷麗，周勝華

(1.揚州大學附屬蘇北人民醫院心內科，江蘇揚州 225001；2.中南大學湘雅二醫院心內科，湖南長沙 410000)

冠脈側支循環形成過程即為動脈血管新生的過程，可為冠脈閉塞患者提供替代的冠脈灌注途徑，冠脈側支循環發展良好的冠心病患者保留有更好的心臟功能，更少受不良心血管事件的影響，病死率亦更低，因此冠脈側支循環在冠心病慢性閉塞(CTO)患者中具有重要的臨床意義。microRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，通過mRNA轉錄后抑制或誘導其降解調節基因表達。資料表明microRNA可作為區分患者是否患有心血管疾病的生物標志物，這類疾病主要包括心力衰竭，穩定性心絞痛及急性心肌梗死，然而至今有關microRNA與冠心病側支循環的關系研究仍鮮有報道[1]。microRNA-21(miR-21)已被證實為多種腫瘤的生物標志物，近來研究表明其在促進血管新生中亦起重要作用[2]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下誘導產生的一種轉錄因子，參與機體對缺氧的反應，研究表明亦有促進血管新生的作用。研究表明miR-21可調控HIF-1α的表達[3-4]。本研究主要探討不同側支循環的CTO冠心病患者中循環miR-21表達的差異，并進一步明確miR-21是否可作為預測冠脈側支循環是否良好的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年8月至2017年8月在本院住院治療的冠心病患者95例，男60例，女35例，年齡40～79歲(55.7±17.2)歲，均行冠脈造影證實前降支、回旋支或右冠狀動脈至少有一支為CTO病變，根據冠脈側支循環是否良好分為側枝良好組53例，側枝不良組42例，所有患者均有超過4周的心絞痛癥狀，符合冠心病診斷標準。排除標準包括：既往心肌梗死、心臟外科手術、左心功能不全、糖尿病、急慢性炎癥、冠狀動脈心肌橋、瓣膜性心臟病、周圍血管疾病、血液系統疾病、腦血管疾病、腫瘤及重要臟器嚴重功能障礙等。排除糖尿病主要因其對冠脈側支循環及microRNA表達有潛在影響[5-6]，因此排除此類患者有利于明確microRNA表達水平與冠脈側支循環的關系。選取同期行冠脈造影正常的住院患者30 例作為對照組，男19例，女11例，年齡39～79(56.3±18.1)歲。 各組患者性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。同時收集其他一般臨床資料，主要包括高血壓、高脂血癥病史、吸煙史及相關用藥史[如拜阿司匹林、氯吡格雷、他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ACEI/ARB)、鈣通道阻滯劑(CCB)、硝酸酯類藥物、倍他樂克、低分子肝素等]，上述指標在CTO兩組患者中比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過本單位倫理委員會批準，所有研究對象均書面知情同意。

1.2方法

1.2.1冠狀動脈側支循環情況評估 根據冠脈側支循環Rentrop分級標準[7]評估冠狀動脈側支循環:0 級為未見側支循環；1 級為分支冠脈充盈，但主要的心外膜冠脈未見顯影;2級為主要心外膜冠脈部分充盈；3級為主要心外膜冠脈完全顯影。0、1級者為冠脈側支循環功能不良組(42例)，而2、3 級者為冠脈側支循環功能良好組(53例)。

1.2.2miR-21、HIF-1α 表達水平檢測及白細胞計數 各組患者在行冠狀動脈造影術前，于主動脈根部抽取血樣本10 mL，注入事先準備好的無菌檸檬酸鹽試管中，然后置入冰中，并以1 500×g離心20 min，血漿儲存于-80 ℃無RNA酶的小瓶中待用。實時熒光定量PCR法測定血漿miR-21相對表達水平，ELISA 法測定血漿HIF-1α水平，計算白細胞、單核細胞及淋巴細胞總數。

2 結 果

2.1兩組白細胞、淋巴細胞及單核細胞計數比較 側支循環良好組單核細胞計數較側支不良組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組白細胞、淋巴細胞及單核細胞計數的比較

a：P<0.05，與側支不良組比較

2.2兩組血miR-21、HIF-1α表達水平比較 側支良好組較側支不良組血漿miR-21、HIF-1α表達水平明顯升高；CTO組miR-21、HIF-1α表達水平較正常對照組減少，差異有統計學意義 (P<0.05)，見表2。

表2 各組血miR- 21、HIF-1α水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與側支不良組比較

2.3冠心病患者側支循環形成的影響因素 相關分析顯示血漿miR-21表達水平與 HIF-1α表達水平及單核細胞計數呈正相關 (r=0.804，P<0.05；r=0.784，P<0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示miR-21(OR=4.762，95%CI為2.395～6.164，P<0.05) 及 HIF-1α水平(OR=12.906，95%CI為11.774～15.048，P<0.05) 是CTO患者側支循環形成良好的預測因子。

2.4血漿miR-21預測效能 根據Logistic回歸分析的概率值繪制ROC曲線，AUC為0.93(95%CI0.79～0.95，P<0.05)，應用血漿 miR-21表達水平預測CTO患者側支循環形成的靈敏性及特異性分別為87.5%、94.1%。

3 討 論

近年來miR-21調節血管新生的作用已成為研究熱點。研究發現在常氧條件下miR-21可抑制內皮細胞介導的血管新生[8]，而其他研究人員在腫瘤細胞中研究發現miR-21通過激活Akt信號促進血管新生[9]，因此miR-21在不同的細胞類型中發揮血管新生的調節作用不同。既往研究證實miR-21可顯著縮小急性心肌梗死患者心肌梗死面積，表明miR-21在缺血缺氧環境中可促進血管新生。其機制可能與miR-21作用于10號染色體q23有缺失且與張力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)有關，因后者可以抑制Akt的活化，而Akt活化可促進血管新生。因此miR-21可通過PTEN/Akt信號途徑促進缺血缺氧性血管新生。

盡管目前研究表明miR-21與血管新生的關系密切，但鮮有臨床研究報道miR-21與冠脈側支循環功能程度有關。本研究表明miR-21水平在側支循環良好的CTO患者血漿中表達明顯增加，并進一步證實miR-21可作為血漿循環標志物用來區分CTO患者側支循環是否良好(靈敏性及特異性分別為87.5%、94.1%)。有趣的是與冠脈造影正常患者相比，CTO患者血漿中miR-21表達明顯減少，提示miR-21可能是CTO冠心病患者的不利因素。

目前microRNA表達水平與冠心病冠脈側支循環功能關系如何知之甚少，本研究假定冠心病患者中側支循環功能程度不同，其血漿中miR-21表達水平亦不同，結果證實miR-21表達水平與冠脈側支循環程度呈正相關，miR-21可用來區分冠心病患者冠脈側支循環功能是否良好，其水平升高提示冠脈側支循環功能良好，這一點在識別并發急性冠脈綜合征高風險患者顯得尤為重要。資料表明側支循環豐富的冠心病患者有利于改善其生存率[10]，令人遺憾的是目前尚缺乏循環標志物來區分這類高風險患者。由于miR-21在患者血漿中表達穩定，有明顯組織特異性，而且隨所處環境反應快速，本研究證實在預測CTO患者冠脈側支循環情況時其敏感度及特異度均較高，因此miR-21作為簡單易測的生物標志物可用來預測冠脈側支循環是否良好，有利于指導高危冠心病患者的治療及改善其預后。

循環中白細胞尤其是其中的單核細胞在冠脈側支循環中起重要調節作用，研究表明冠脈側支循環功能良好與血液循環中低水平的白細胞總數及高水平的單核細胞有關[11]，本研究結果表明冠脈側支循環良好組單核細胞明顯升高，與前述研究一致，進一步行相關分析發現miR-21與循環中單核細胞存在明確正相關，推測其機制可能與單核細胞分泌miR-21有關[12]。此外有研究發現淋巴細胞計數與冠脈側支循環功能是否良好相關[13]，本研究顯示淋巴細胞計數及白細胞總數在冠脈側支循環良好組及不良組間比較均無明顯差別，這可能與本研究選擇CTO冠心病患者作為研究對象有關。HIF-1α在缺氧條件下有促進血管新生的作用。資料表明HIF-1α可誘導血管內皮生長因子(VEGF)表達而縮小心肌梗死面積。研究顯示HIF-1α表達受miR-21調控[3]，其機制可能與激活Akt信號途徑有關，而后者可促進VEGF的表達。有資料表明在缺氧環境下抑制miR-21可導致心肌細胞HIF-1α表達減少[4]。本研究結果顯示HIF-1α是冠脈側支循環的影響因素，而且miR-21與HIF-1α呈正相關，因此推測在CTO冠心病患者中miR-21通過上調HIF-1α表達而促進冠脈側支循環形成。此外，研究表明HIF-1α可通過上調miR-19a促進單核細胞水平上調及冠狀動脈粥樣硬化發生[14]，本研究亦發現HIF-1α與單核細胞計數呈正相關，因此HIF-1α發揮影響冠脈側支循環的作用可能部分是通過增加血漿中單核細胞計數實現的。

目前明確冠脈側支循環功能情況主要依靠冠脈造影等侵入性檢查方法，而冠脈造影亦僅僅提供一種半定量方法來評估冠脈側支循環功能情況，而且只能探測100 μg以上的血管。因此利用循環標志物如本研究中證實的miR-21因其簡單易操作且無創的方式來區分冠心病患者冠脈側支循環情況就顯得十分有價值。考慮到那些冠脈側支循環功能不良的冠心病患者有更高并發急性冠脈事件的風險及更高的死亡率，因此采用簡單無創的方法有效識別這類患者非常重要。本研究表明miR-21可作為血漿循環標志物有效區分CTO冠心病患者冠脈側支循環功能是否良好，但其具體作用機制尚不明確，因此將來的研究應納入更多的患者群體以進一步明確miR-21在冠脈側支循環中的作用并進行基礎研究探討其作用機制。