重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷對AA大鼠關(guān)節(jié)影像的影響及機制*

王 斌,張 燕,金蘇華,珍 妮

(內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)影像科；2.眼科；3.醫(yī)學(xué)影像科核磁共振室，內(nèi)蒙古牙克石 022150)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以骨關(guān)節(jié)損傷為主要表現(xiàn)的疾病。佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠(AA大鼠)是目前較為公認(rèn)的一種該病模型[1]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎存在難以治愈，疾病進展無法逆轉(zhuǎn)的特點，因此找到一種能有效延緩疾病進展甚至治療該病的治療方法十分重要[2]。威靈仙總皂苷是一種從傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物威靈仙中提取出來的有效成分，有研究顯示其對于AA大鼠的關(guān)節(jié)存在保護作用[3]。hIL-10也常常被應(yīng)用于AA大鼠的研究中，很多研究提示其也對于AA大鼠骨關(guān)節(jié)保護和免疫調(diào)節(jié)存在比較好的效果[4-5]，但是少見將上述兩種藥物聯(lián)合用于干預(yù)AA大鼠的報道，因此本研究正是基于此而進行的，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗對象處理方法 150只SPF級雄性大鼠分為空白組、對照組、觀察組1、觀察組2、觀察組3，每個小組30只。所有大鼠在入組前首先適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，不計入實驗時間。適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后開始計算實驗時間。空白組大鼠不接受任何處理。對照組和3個觀察組先接受造模干預(yù)。具體方法為：(1)80 ℃滅活卡介苗，然后加入弗氏完全佐劑10 mg/mL，作為造模藥品。(2)將上述藥品1 mL用皮下注射的方式注入大鼠左前足底，加強免疫后15 d造模成功。造模結(jié)束后對照組大鼠不接受其他干預(yù)。觀察組1：從第15天開始接受200 mg威靈仙總皂苷灌胃治療，每天1次[6]。觀察組2：從第15天開始接受腹腔注射hIL-10劑量為5 μg/kg[7]。觀察組3：從第15天開始接受腹腔注射劑量為5 μg/kg hIL-10聯(lián)合200 mg威靈仙總皂苷灌胃治療。

1.2各項指標(biāo)檢測方法

1.2.1大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)評分方法 各組大鼠在實驗開始當(dāng)天，第15天和第35天分別接受左前足X線攝片檢查，具體方法為：乳腺鉬靶機(意大利吉特乳腺高頻X線攝像儀)25 kV，1.0 s，4 mA。骨侵蝕評分如下，0分：正常骨質(zhì)；1分：僅有1處微小病灶，或疑似存在病灶；2分：存在兩個病灶或病灶總和大于50%；3分：存在3個或以上病灶，或病灶面積總和大于等于50%；4分：整個關(guān)節(jié)面完全破壞或出現(xiàn)骨萎縮。骨關(guān)節(jié)間隙評分方法如下，0分：關(guān)節(jié)間隙正常；1分：關(guān)節(jié)間隙出現(xiàn)異常狹窄，比正常關(guān)節(jié)間隙變窄25%～50%；2分：關(guān)節(jié)間隙出現(xiàn)異常狹窄，比正常關(guān)節(jié)間隙變窄超過50%；3分：關(guān)節(jié)間隙消失或關(guān)節(jié)強直[9]。

1.2.2大鼠關(guān)節(jié)間隙寬度檢測方法 各組大鼠在實驗開始當(dāng)天，第15天和第35天按1.2.1條件分別接受左前足X線檢查后直接測量大鼠關(guān)節(jié)間隙。在攝片后，取得大鼠關(guān)節(jié)片，然后使用分規(guī)測量大鼠右后膝關(guān)節(jié)中心處關(guān)節(jié)間隙。每次關(guān)節(jié)間隙測量必須由3位不同實驗者重復(fù)進行。

1.2.3大鼠外周血淋巴細(xì)胞檢測方法 各組大鼠被處死后，立即取大鼠外周血200 μL，分為兩管，每管100 μL。第一管加入EDTA抗凝，然后加入抗大鼠FITC-CD4抗體10 μL，PE-CD8抗體10 μL，震蕩避光靜置30 min，加入溶血素2 mL，10 min后離心，棄上清液，加入PBS洗滌1次，最后加入多聚甲醛10滴重懸，流式細(xì)胞分析儀檢測CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，最后比較CD4+/CD8+水平。

1.2.4大鼠外周炎癥因子檢測方法 各組大鼠被處死后，立即取大鼠外周血100 μL，3 000 r/min下離心10 min，小心分離血清，按ELISA試劑盒(新博生物科技公司)使用說明分別檢測IL-17A、IL-6、TNF-α。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算外周血中IL-17A、IL-6和TNF-α濃度。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)評分 實驗進行35 d以后，3個觀察組骨侵蝕、關(guān)節(jié)侵蝕評分均低于對照組(P<0.05)。觀察組3骨侵蝕、關(guān)節(jié)侵蝕評分低于觀察組2和觀察組1(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)間隙寬度情況 實驗進行第35天，3組觀察組大鼠關(guān)節(jié)間隙均寬于對照組。觀察組3大鼠關(guān)節(jié)間隙大于觀察組1和觀察組2(P<0.05)。觀察組1大鼠關(guān)節(jié)間隙大于觀察組2(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)評分分)

a:P<0.05，與空白組比較；b:P<0.05，與對照組比較；c:P<0.05，與觀察組1比較；d:P<0.05，與觀察組2比較

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)間隙寬度變化

a:P<0.05，與空白組比較；b:P<0.05，與對照組比較；c:P<0.05，與觀察組1比較；d:P<0.05，與觀察組2比較

2.3各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞情況 觀察組3 CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+顯著低于對照組、觀察組1、觀察組2。3個觀察組CD8+T細(xì)胞顯著高于對照組和空白組，見表3。

表3 各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞變化情況

a:P<0.05，與空白組比較；b:P<0.05，與對照組比較；c:P<0.05，與觀察組1比較；d:P<0.05，與觀察組2比較

2.4各組大鼠外周血炎癥因子情況 空白組IL-17A、IL-6、TNF-α低于對照組和3個觀察組(P<0.05)。3個觀察組IL-17A、IL-6、TNF-α均低于對照組(P<0.05)。上述指標(biāo)觀察組3低于觀察組1(P<0.05)，觀察組1低于觀察組2(P<0.05)，見圖1。

a:P<0.05，與空白組比較；b:P<0.05，與對照組比較；c:P<0.05，與觀察組1比較；d:P<0.05，與觀察組2比較

圖1各組大鼠干預(yù)后外周血炎癥因子水平情況

3 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要病理學(xué)特點為滑膜的慢性炎癥和血管增生[10]。在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中，除了骨關(guān)節(jié)損傷外，伴隨著較為嚴(yán)重的免疫失調(diào)[11-12]。

AA大鼠是一種常見的用以模擬人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型，本研究以AA大鼠為研究對象，探討重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷對患者骨關(guān)節(jié)的保護作用，和免疫細(xì)胞比例及炎癥因子紊亂的改善作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷可以有效降低AA大鼠骨侵蝕評分和關(guān)節(jié)侵蝕評分。并且這種作用明顯優(yōu)于單用重組hIL-10和威靈仙總皂苷。這說明這兩種藥物在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的時候存在著協(xié)同效應(yīng)。為了進一步觀察治療方案對關(guān)節(jié)的保護作用本研究還測量了大鼠關(guān)節(jié)間隙，發(fā)現(xiàn)重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷也可以有效保護大鼠關(guān)節(jié)，防止大鼠關(guān)節(jié)強直維持正常的關(guān)節(jié)間隙。

本研究還檢測了各組大鼠的外周血炎癥因子和外周血淋巴細(xì)胞比例，隨著疾病進展，AA大鼠外周血IL-17A、IL-6、TNF-α?xí)@著升高，但是在使用了不同治療方案后上述3種炎癥因子均得到了不同程度的回落，尤其是使用重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷治療的大鼠上述炎癥因子回落尤其明顯。這說明重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷可以有效地降低上述3種炎癥因子。有研究提示TNF-α抑制劑的使用可以有效地降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)炎癥情況，降低外周血類風(fēng)濕因子的功能，延緩關(guān)節(jié)影像學(xué)進展[13]。也有文獻支持IL-10可以有效降低可溶性TNF受體和TNF-α[14]。IL-6是與RA存在很多關(guān)聯(lián)的多效細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)JAK/STAT3通路導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15]。IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子可以促進滑膜炎癥[16]。重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷可以降低上述3種炎癥因子，其改善AA大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)表現(xiàn)的重要機制之一。

本研究也發(fā)現(xiàn)AA大鼠相對于正常大鼠CD4+T細(xì)胞顯著升高而CD8+T細(xì)胞數(shù)量未發(fā)生明顯改變，因此CD4+/CD8+也顯著升高。而經(jīng)過治療的AA大鼠CD4+T細(xì)胞顯著下降，CD8+T細(xì)胞顯著升高，因此CD4+/CD8+也顯著降低。接受重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷治療的AA大鼠CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+降低尤其明顯。CD4+T細(xì)胞可以有效刺激B細(xì)胞，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物更多地沉積于滑膜，導(dǎo)致滑膜炎癥，而CD4+/CD8+也可以提示體內(nèi)免疫狀態(tài)，所以重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷可以有效地調(diào)理患者免疫狀態(tài)[17-18]。

綜上所述，重組hIL-10聯(lián)合威靈仙總皂苷可以通過降低AA大鼠外周血促炎的炎癥因子，降低CD4+T細(xì)胞調(diào)理AA大鼠免疫狀態(tài)，從而改善AA大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)表現(xiàn)，可以進一步進行臨床試驗。