miR-148a-3p抑制NRAS表達調控乳腺癌細胞增殖與凋亡的機制

李 楊，張 季，楊思原，謝 琳

(云南省腫瘤醫院/昆明醫科大學第三附屬醫院:1.腫瘤內科;2.乳腺科，昆明 650118)

乳腺癌(BC)每年約有130多萬新發病例和45萬死亡病例[1]，是導致女性死亡的主要原因。根據癌細胞是否表達雌激素受體(ERα)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體-2(HER2)，可將乳腺癌分為ERα+，HER2+和三陰性乳腺癌(TNBC)3種類型[2]。雖然乳腺癌的發病尚無明確觀點，但國內外大量研究標明微小RNA(microRNA)參與調控多種惡性腫瘤的發生、發展，microRNA在核糖核酸(RNA)沉默和調控基因表達的轉錄后翻譯等過程中發揮重要作用[3-4]。2016年研究發現，miR-148a-3p可抑制膀胱癌等多種惡性癌細胞的增殖[5]，miR-148a-3p在乳腺癌是否也存在類似作用。本研究旨在探討miR-148a-3p對乳腺癌細胞增殖的影響及在乳腺癌中發揮作用的可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌MCF-7細胞株和MCF-10A細胞株，雌激素受體陽性，購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.2主要儀器與試劑 凝膠電泳儀、垂直電泳槽及凝膠成像系統(Bio-rad，美國)，實時熒光定量PCR儀ABI 7300(Applied Biosystems，美國)，青霉素-鏈霉素混合溶液(Sigma，美國)，miR-148a-3p模擬物和對照載體(上海吉碼生物科技有限公司)，pGL3熒光素酶檢測系統(Promega，美國)，DEPC水(碧云天生物生物科技公司)，熒光定量試劑盒One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit(大連寶生物有限公司)，PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、兔抗神經母細胞瘤病毒性ras致癌因子的同原體(NRAS)及辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗(Abcam，美國)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、AnnexinV-FITC/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)凋亡試劑盒、SDS/PAGE電泳凝膠混合液及ECL顯色試劑(碧云天生物生物科技公司)。微量紫外可見光分光光度計、恒溫培養箱、超凈工作臺、改良Eagle培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Opti-MEM培養基、Lipofectamine?3000、質粒提取試劑盒、Trizol試劑和蛋白Maker(Thermo，美國)。

1.3方法

1.3.1細胞培養及轉染 人乳腺癌細胞株-7(MCF-7)細胞株用10% FBS和90%DMEM培養液培養，加入1% 青霉素-鏈霉素，置于37 ℃，5% CO2的培養箱，培養過夜。將MCF-7細胞接種于6孔板內，1×105個/孔，待細胞匯合率達到約80%，用Lipofectamine?3000轉染試劑將miR-148a-3p的模擬物和miR-148a-3p進行轉染，待轉染48 h，備用。MCF-7細胞未經轉染處理為未轉染組，根據MCF-7細胞是否轉染及是否存在miR-148a-3p分為3個組：未轉染組、miR-148a-3p對照組和miR-148a-3p轉染組。

1.3.2四唑鹽比色法(MTT)細胞增殖實驗 將3個組細胞接種于6孔板內，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，放回細胞培養箱內繼續培養。4 h后，根據450 nm酶標儀比色測定的每孔的吸光度值(A)來分析細胞增殖情況。

1.3.3提取總RNA 將3組細胞收集細胞至EP管并加入1 mL Trizol試劑和0.2 mL氯仿，用力震蕩后室溫靜置3 min，在4 ℃低溫離心機12 000 r/min 離心15 min。吸取上層水相，轉至新的EP管，加0.5 mL異丙醇，室溫靜置20 min，在4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min。棄上清液，得到白色沉淀，即核糖核酸(RNA)。用75%乙醇洗滌RNA 2次，室溫晾干，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外分光光度計測定RNA溶液的純度，即A260 nm/A280 nm的比值，為1.8～2.1。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗 反轉錄用 TaKaRa PrimeScript 試劑盒的 SYBR GreenAssay。反應體系：5倍的PrimeScript緩沖液 2 μL，反轉錄酶 0.5 μL，寡核苷酸 0.5 μL，6核苷酸的隨機引物 0.5 μL，把總 RNA 定量至500 ng，不含RNase的雙蒸水定容終體系為 10 μL。反轉錄流程：將上述反轉錄體系在37 ℃ 水浴15 min，85 ℃水浴持續5 s。用cDNA為模板采用 7300 Real-time PCR 系統(Applied Biosystems,美國)進行RT-qPCR檢測。反應體系：2 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，5 μL 2×混合緩沖液和2 μL dd水。反應條件：95 ℃ 10 min，持續40個循環：60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，溶解曲線 60～90 ℃。以公式2-ΔΔCt進行計算，ΔCt=Ct 基因-Ct內參，U6 為內參。分析3組細胞miR-148a-3p mRNA表達。

1.3.5Western blot檢測 MCF-7細胞轉染48 h后，收集細胞。用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗細胞3次，4 ℃ 超低溫離心機1 000 r/min離心5 min，棄上清液。按沉淀質量/體積1∶5加入里帕(RIPA)蛋白裂解液，超聲勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液。利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白質濃度，將每組樣本分別置于1.5 mL EP管中。蛋白樣品中加入等體積的2倍十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水5 min使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白采用濕轉法將凝膠分離后的蛋白轉移到硝酸纖維素(PVDF)膜上。室溫下，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，洗滌分別加入NRAS及 GAPDH的一抗(1∶100)4 ℃搖床孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗滌3次后，用化學發光法(ECL)顯色液顯色，GAPDH為內參，凝膠成像設備觀察3組細胞miR-148a-3p蛋白表達。

1.3.6流式細胞術檢測細胞凋亡 將3個組細胞用PBS洗2次，向各組細胞加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL碘化丙啶(PI)室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.3.7miR-148a-3p的靶基因預測 采用生物信息學軟件Targetscan預測miR-148a-3p可以結合NRAS的3′端非翻譯區(UTR)。

1.3.8雙熒光素酶報告基因 構建野生型和突變型NRAS-3′UTR的報告基因質粒，并將所得質粒及pRL-TK質粒，miR-148a-3p 模擬物及miR-148a-3p轉染到MCF-10A細胞中，48 h之后按照雙熒光素酶檢測說明書檢測細胞的相對熒光強度(熒光蟲熒光強度/猴腎熒光強度)。

2 結 果

2.1不同組別的miR-148a-3p表達 與未轉染組和miR-148a-3p對照組相比，miR-148a-3p轉染組的miR-148a-3pmRNA顯著升高 (P<0.05) ，見圖1。

*:P<0.05，與未轉染組和miR-148a-3p對照組比較

圖1不同組別的miR-148a-3p表達

2.2不同組別的細胞增殖的情況 與未轉染組和miR-148a-3p對照組相比，miR-148a-3p轉染組的MCF-7細胞的增殖能力最低 (P<0.05)，見圖2。

*:P<0.05，與未轉染組和miR-148a-3p對照組比較

圖2不同組別的細胞增殖率

A：Western blot；B：NRAS表達；*:P<0.05，與未轉染組和miR-148a-3p對照組比較

圖3不同組別的NRAS蛋白表達

2.3miR-148a-3p與NRAS-3′UTR的關系 NRAS-3′UTR序列與miR-148a-3p序列間存在特定結合區域，NRAS可能是miR-148a-3p的靶點。

2.4不同組別的NRAS表達 與未轉染組和miR-148a-3p對照組相比，miR-148a-3p轉染組的NRAS的mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，見圖3、4。

*:P<0.05，與未轉染組和miR-148a-3p對照組比較

圖4不同組別的NRASmRNA表達

2.5不同組別的凋亡情況 與未轉染組和miR-148a-3p對照組相比，miR-148a-3p轉染組的凋亡明顯(P<0.05)，見圖5。

圖5 不同組別的凋亡情況

2.6miR-148a-3p與NRAS-3′UTR的關系miR-148a-3p顯著抑制野生型NRAS-3′UTR質粒轉染的細胞的熒光素酶活性(P<0.05)，對突變型NRAS-3′UTR質粒轉染細胞的熒光素酶活性并無明顯的影響(P>0.05)，見圖6。

*:P<0.05

圖6 miR-148a-3p與NRAS-3′UTR的關系

3 討 論

microRNA是一類廣泛存在于植物，動物甚至病毒體內的包含約22個核苷酸的小的非編碼RNA，在RNA沉默和調控基因表達的轉錄后翻譯等過程中發揮作用[3-4]。miRNA在細胞的生長和分化及信息傳遞等過程中均扮演重要的角色。近年來研究表明miRNA在腫瘤的發生和發展過程中發揮促癌或抑癌的作用,影響進而腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移等行為學[6]。miR-148a-3p位于7p15.2染色體區域，是已知的腫瘤抑制因子[7]。近年研究顯示miR-148a-3p在多種惡性腫瘤發揮重要作用：(1) miR-148a-3p可以通過抑制BMP信號通路抑制胃癌細胞系的侵襲和轉移[8]；(2)miR-148a-3p通過調節ERBB3/AKT2/c-myc 和 ERBB3/AKT2/Snail 等信號通路抑制膀胱癌細胞增殖[5]；(3)miR-148-3p在喉鱗狀細胞癌中嚴重減少，通過DNMT1調節RUNX3的表達抑制細胞增殖[9]。與之前的研究類似，本研究結果顯示，在乳腺癌MCF-7細胞中瞬時過表達miR-148a-3p可以顯著抑制細胞的增殖，并促進細胞凋亡，但乳腺癌MCF-7細胞中miR-148a-3p的作用通過何種下游分子實現還未見相關報道。本研究發現在MCF-7細胞中瞬時過表達miR-148a-3p后，與未轉染組和miR-148a-3p對照組相比，miR-148a-3p 轉染組NRAS的mRNA及蛋白水平明顯下降，雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-148a-3p直接靶向NRAS-3′UTR。NRAS是NRAS基因編碼的一種酶，由Robin Weiss等首次在神經母細胞瘤中發現[10-11]。人類的ras基因共分為HRAS，KRAS和NRAS等3種基因，他們擁有結合GTP/GDP及GTPase的能力，正常生理狀態下控制細胞的正常生長。12、13或61位氨基酸殘基的突變可以激活N-ras的潛能，并促進腫瘤的惡化，例如黑色素瘤[12]；另外，在伊朗人群中，結直腸癌患者體內發現有NRAS基因的突變[13]；NRAS siRNA可以顯著抑制肺癌細胞的活性[14]。現研究明確的NRAS信號通路的下游有2種，即MAPK 信號通路和 PI3K/AKT/mTOR 信號通路[15-16]。本研究的結果與之前關于NRAS在腫瘤中作用的報道一致。本課題也存在以下兩方面的問題：(1)研究指出與耐藥胃癌細胞系相比，非耐藥胃癌細胞系的miR-148a-3p表達相對較高，本課題未進行耐藥MCF-7細胞的研究，探討miR-148a-3p的作用仍較單薄[11]；(2)miR-148a-3p靶向NRAS-3′UTR抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖過程所涉及的具體的分子，未做研究，具體將在未來工作中開展并探討。綜上所述，本課題結果顯示乳腺癌MCF-7細胞中，miR-148a-3p通過靶向NRAS-3′UTR調控細胞的增殖與凋亡，提示miR-148a-3p可以作為治療乳腺癌新的靶點，miR-148a-3p高表達可能與乳腺癌良好預后相關。