G-CSF增加三氧化二砷對骨髓增生異常綜合征細胞系SKM-1的細胞毒作用

雷美清,羅賢生,王智明,孫令鳳,楊曉陽,余 鋒,陳曉霞

(中南大學湘雅醫學院附屬海口市人民醫院血液科 570208)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一種異質性很強的造血干細胞水平的惡性腫瘤，它屬于髓系惡性腫瘤的一個分支[1]。其臨床特征有無效造血所致的血細胞減少，高風險向急性白血病轉化。MDS 發病率呈逐年上升趨勢。由于絕大多數患者發病年齡較大，因此傳統化療方案和異基因造血干細胞移植并非廣泛適用[2]。早期臨床研究報道了三氧化二砷(As2O3)可以明顯改善MDS患者的血液學反應[3]，鑒于單純使用As2O3治療的濃度偏高，不良反應大，易形成耐藥性。一些以As2O3為基礎的聯合治療用于MDS的嘗試也在不斷地探索中[4-6]。事實上，大多數化療藥主要殺滅處于增殖期白血病細胞。最近有文獻報道重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能動員休眠期的白血病干細胞進入細胞周期，從而增加它們對化療藥物的敏感性。事實上，As2O3皆有誘導腫瘤細胞進入周期和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但其具體作用機制未明[7-8]。由此推測G-CSF聯合As2O3可能對MDS細胞有一定的協同效應。本研究以難治性貧血伴有原始細胞增多類型(MDS-RAEB)的細胞系SKM-1細胞為研究對象，比較As2O3聯合或不聯合G-CSF對SKM-1細胞的抑制增殖和誘導凋亡作用及其可能的機制，現報道如下。

A:各組細胞周期的分布，B:各組對應的S期細胞比例；a：P<0.05;b：P<0.01

圖1不同濃度G-CSF作用48 h對SKM-1細胞周期的影響

1 材料與方法

1.1細胞株 SKM-1屬于MDS-RAEB型細胞株，由江蘇省血液研究所保存。細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養，培養基在37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱內培養，每2至3天傳代1次，取對數生長期細胞進行藥物干預實驗。

1.2藥物和試劑 G-CSF(150 μg/支)購自齊魯制藥有限公司，用PBS配制成濃度為10、20、40 ng/mL。注射用As2O3購自北京雙鷺藥業股份有限公司，先用PBS配制藥物濃度5×103μmol/L(母液)，使用前再稀釋至所需As2O3濃度(2.5、5.0、10.0 μmol/L)。RPMI 1640培養液、胎牛血清購自HyClone公司。

1.3方法

1.3.1細胞周期分析 取對數生長期的SKM-1細胞，調整細胞密度至2×105/mL，置于48孔培養板(每孔1 mL)，分別加入不同濃度的G-CSF(10、20、40 ng/mL)為預處理實驗組，以不加G-CSF為空白對照組，作用48 h后收集細胞，PBS洗滌1次后70%乙醇固定過夜。參考細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，用FC500流式細胞儀檢測。采用MultiCycle軟件分析細胞周期。實驗重復3次。

1.3.2CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 取對數生長期的SKM-1細胞，調整細胞密度至2×105/mL后接種于96孔培養板(每孔90 μL)，分為實驗組、對照組、空白組，實驗組采用20 ng/mL G-CSF預處理24 h，以不加G-CSF為對照組，對照組和實驗組分別加入不同濃度的As2O3(2.5、5.0、10.0 μmol/L)10 μ L，空白組(僅有SKM-1細胞)加等體積的RPMI 1640培養液，繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃、5%CO2孵育箱內培養3 h，用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值。每組設3個平行孔，實驗重復3次，并按下列公式計算As2O3對細胞增殖抑制率=(對照孔-實驗孔)/(對照孔-空白孔)×100%。

1.3.3細胞凋亡的檢測 細胞處理方法類似于細胞增殖實驗，實驗孔和對照孔在加入不同濃度As2O3作用48 h后，用PBS洗滌2次，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，進行流式細胞檢測。總凋亡率=早期凋亡率(右下象限)+晚期凋亡率(右上象限)。

2 結 果

2.1細胞周期分析 不同濃度G-CSF分別作用于SKM-1細胞株48 h，S期細胞比例呈現隨G-CSF濃度增加而升高的趨勢；盡管S期比例在10 ng/mL G-CSF預處理實驗組與空白對照組之間的差異無統計學意義，但是20、40 ng/mL G-CSF預處理實驗組與空白對照組相比，S期細胞比例差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。選擇20 ng/mL G-CSF預處理作為聯合As2O3實驗的基礎。

2.2不同濃度As2O3和G-CSF聯合對SKM-1細胞增殖抑制作用 采用CCK-8法測定不同濃度As2O3作用48 h后SKM-1細胞增殖抑制率，結果顯示2.5、5.0、10.0 μmol/L As2O3實驗組細胞增殖抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05;b：P<0.01

圖2各組組對SKM-1細胞增殖作用比較

2.3G-CSF聯合不同濃度As2O3對SKM-1細胞凋亡的影響 2.5、5.0、10.0 μmol/L As2O3對照組細胞凋亡率分別為3.22%、9.33%、39.22%，對應濃度的實驗組細胞凋亡率分別為17.67%、46.09%、65.51%；同一濃度As2O3的實驗組細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖3。

A:空白組，2.5、5.0、10.0 μmol/L As2O3濃度對照組(上排)和實驗組(下排)的細胞凋亡圖；B:各組對應的凋亡的比例；a：P<0.05

圖3各組對SKM-1細胞凋亡作用的影響

3 討 論

MDS的發病機制目前尚未被闡明，可能與分子遺傳、造血微環境改變、造血干/祖細胞增殖和凋亡紊亂及抑癌基因甲基化等多因素有關[9]。研究發現細胞凋亡及增殖的失調被認為是MDS 發病機制中重要組成部分，到晚期則以異常克隆增殖為主，骨髓造血以高增殖低凋亡為主要表現[10]。作為治療急性早幼粒細胞白血病的經典藥物As2O3，低濃度As2O3(0.1～0.5 μmol/L)只引起細胞分化，繼續增加濃度則發揮誘導細胞凋亡作用[11]。由于As2O3在細胞內代謝時既消耗了甲基化所需的原料同時又降低了甲基化轉移酶的數量和活性，有可能也發揮著去甲基化作用。因此，基于As2O3單藥或者As2O3聯合其他藥用于MDS的治療應運而生，有研究表明：G-CSF可以增強低濃度As2O3對APL細胞系的誘導分化作用[12]。為進一步探討G-CSF與As2O3在MDS細胞株SKM-1中是否也具有協同效應，因此本實驗選擇2.5～10.0 μmol/L As2O3為作用于SKM-1細胞的藥物濃度，從而為臨床上治療MDS提供新的思路和方法。

在細胞周期實驗中，本研究采用FCM檢測G-CSF作用SKM-1細胞后周期的變化，與對照組相比。結果顯示，G-CSF作用48 h顯示S期細胞的比例明顯增高，并隨著藥物濃度的增加這種作用會越來越明顯，對照組和實驗組之間差異具有統計學意義(P<0.05)。值得注意的是以往的文獻報道G-CSF誘導白血病細胞S期比例增加時，G0/G1期比例減少[13]，而本研究的結果提示G-CSF動員S期比例增多時，G2/M期比例減少，這可能與細胞株和作用時間不同等因素有關。而G-CSF與As2O3兩者聯合作用的結果又將如何? 與對照組相比，實驗組對SKM-1的增殖抑制率和誘導凋亡率明顯高于對照組，并呈濃度依賴性，同一濃度的實驗組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。盡管As2O3對腫瘤細胞有誘導分化和凋亡的雙重作用。而本研究采用As2O3屬于高濃度范圍，所以本實驗的流式檢測范圍主要針對其對SKM-1的誘導凋亡作用，而未進行分化指標的相關檢測。本研究的As2O3單藥誘導的凋亡作用類似于以往用As2O3單藥作用SKM-1的研究[14]，并且，在同一濃度As2O3作用下，聯合20 ng/mL的G-CSF所產生的抑制增殖和誘導凋亡作用均較單獨使用同濃度As2O3明顯增強(P<0.05)。由此推斷，G-CSF聯合As2O3可能是通過招募靜息期的白血病細胞進入S期，從而增加SKM-1細胞對As2O3治療的敏感性。

臨床上，G-CSF或者As2O3在MDS患者中的應用具有較好的耐受性。由于MDS疾病具有極大的異質性，包括MDS的不同分型白血病細胞表達G-CSF受體存在差異[15]，因此，本實驗的結果還需要在MDS的不同細胞株中進行驗證。此外，臨床上關于預激的時間不完全統一，在本實驗中，盡管G-CSF對SKM-1細胞的S期轉化的最佳時間是48 h， 考慮到后續G-CSF和As2O3共同作用的時間還有48 h，所以本實驗選擇G-CSF預激作用24 h的基礎上加As2O3繼續作用48 h，這樣的序貫加藥的時間與以往文獻報道的預激方案相似[16]。最后，本實驗只涉及As2O3聯合G-CSF對SKM-1對增殖和凋亡的影響，其實As2O3本身也影響白血病干細胞的細胞周期[8]，而且相互作用的分子和信號通路尚不明確。所以關于G-CSF和As2O3對SKM-1的協同作用還需要在體外實驗和臨床應用中進一步探討[17]。

綜上所述，20 ng/mL的G-CSF可以增強高濃度As2O3對MDS細胞系SKM-1的誘導凋亡作用。機制可能與G-CSF轉化細胞周期有關，提高白血病細胞對As2O3抑制增殖和誘導凋亡的敏感性。當然，這還需要進一步研究加以證實。同時,這也是中藥現代化的重要內容，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。