EGCG對人肺癌細(xì)胞NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

黃 潔,李承紅,孟慶華,王小江,陳 實,石 奕

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院/武漢市第六醫(yī)院呼吸內(nèi)科 430016)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床生存率遠不足10%的以肺腺癌細(xì)胞和肺鱗狀上皮癌細(xì)胞的增殖異常為主要特征的癌癥[1-3]。表皮生長因子受體(EGFR)突變NSCLC病患常表現(xiàn)為常規(guī)治療藥物的耐藥和低效[4]。因此，尋找新型藥物迫在眉睫。EGFR是調(diào)控細(xì)胞生長參與癌癥病程的酪氨酸激酶受體[5-7]。且EGFR(Tyr845)/ERK/AKT信號通路參與增殖等多細(xì)胞應(yīng)答[8-10]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中具有抗菌、增強免疫力和抗腫瘤活性的兒茶素[11-12]。且EGCG可增強癌細(xì)胞對化療的敏感性[13-15]。然而，在EGCG對NSCLC治療沒有詳細(xì)的研究基礎(chǔ)。本研究利用公認(rèn)的NSCLC的肺腺癌和肺鱗狀上皮癌細(xì)胞系，對EGCG的體外抗NSCLC作用進行探索性研究，分析其對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 EGCG購于美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)RPMI 1640和Opti-MEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞系購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。脂質(zhì)體LipofectamineTM3000、cDNA 合成試劑盒購于美國Thermo 公司，蛋白酶抑制劑cocktail、磷酸化酶抑制劑、RIPA裂解、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑、RNase A購自碧云天生物有限公司)，抗CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6購自美國Cell Signaling Technology公司，cleaver-caspase 3、cleaver-caspase 9、Bax、Bcl2購自武漢proteintech 公司，p65、phospho-p65、EGFR、phospho-EGFR(Tyr845)、phospho-AKT(Ser473)、AKT、phospho-ERK、ERK購自于武漢Abclonal公司。EGFR siRNA由廣州銳博生物設(shè)計合成(EGFR siRNA序列：CAC AGU GGA GCG AAU UCC U，Control siRNA序列：GGA CUU GGA UGA AG AAA UC)，其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞以10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)傳代。細(xì)胞經(jīng)消化計數(shù)后，以2×104個/孔的數(shù)量接種到12孔培養(yǎng)板中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)6 h。實驗分為Control siRNA組、EGFR siRNA組和EGFR siRNA+EGCG組。依照脂質(zhì)體LipofectamineTM3000使用說明書，各孔加入相應(yīng)Control siRNA 50 ng/μL、EGFR siRNA 50 ng/μL和EGFR siRNA 50 ng/μL+EGCG 20 μmol/L后孵育24 h，收集細(xì)胞做蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.2.2CCK-8比色法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖實驗采用CCK-8比色法檢測，參照CCK-8試劑盒說明書，細(xì)胞經(jīng)消化計數(shù)后，以2×103個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)6 h后，更換2% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h同步化，依次加入0、20、40、80、160、320 μmol/L EGCG處理24、48、72 h的EGCG組。每孔加入10 L的CCK-8溶液，混勻后培養(yǎng)2 h后于450 nm處檢測各孔光密度(A)值，繪制細(xì)胞增殖統(tǒng)計圖，同時以2×104個/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，經(jīng)相同處理后收集細(xì)胞做蛋白質(zhì)印跡檢測和q-PCR檢測。

1.2.3Annexin V/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測凋亡 對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化計數(shù)后，1×105個/孔的數(shù)量接種到6孔培養(yǎng)板中，37℃ 5% CO2培養(yǎng)6 h后，更換2% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h同步化，依次加入0、20、40、80、160、320 μmol/L EGCG處理24 h的EGCG組。每孔細(xì)胞以乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化收集細(xì)胞，冷PBS漂洗2次，依照Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑說明操作。采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化計數(shù)后，1×105個/孔的數(shù)量接種到6孔培養(yǎng)板中，按照“1.2.1”實驗方法處理。每孔細(xì)胞以EDTA消化液消化收集細(xì)胞，加入75%冷乙醇后4 ℃固定過夜，冷PBS漂洗兩次，加入300 μL PBS，10 mg/mL RNase A溶液15 L混勻后，37 ℃孵育30 min，加入1 mg/mL 碘化丙啶(PI)染料溶液混勻后，閉光孵育30 min，PBS漂洗2次，加入200 μL PBS重懸細(xì)胞。采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測EGFR及相關(guān)蛋白的表達 EGCG和EGFR siRNA處理后的NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞用細(xì)胞總蛋白提取、BCA蛋白濃度監(jiān)測方法收集細(xì)胞裂解上清。加入5×loading buffer于95 ℃干熱變性10 min。制作4%的濃縮膠和12%的分離膠，電泳后濕法轉(zhuǎn)膜2 h至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，然后使用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，AKT、CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6、Bax、Bcl2、P65和EGFR、ERK抗體按1∶1 000比例稀釋，cleaver-caspase 3、cleaver-caspase 9、phospho-p65、phospho-EGFR、phospho-AKT、phospho-ERK抗體按1∶800比例稀釋，內(nèi)參b-actin抗體按1∶5 000比例稀釋，4 ℃搖床孵育16 h后，TBST漂洗后孵育相應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，按1:8 000比例稀釋，室溫輕搖孵育2 h，采用ECL法顯影。

2 結(jié) 果

2.1EGCG誘導(dǎo)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡 EGCG在不同劑量和作用時間上明顯誘導(dǎo)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡(P<0.05)，但是，相同濃度的EGCG作用NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞24 h與作用48、72 h相比，凋亡率相當(dāng)，不同濃度的EGCG作用(0、20、40、80、160、320 μmol/L)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞相同時間(24、48、72 h)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 EGCG抑制NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡

2.2EGCG抑制細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白的表達 與0 μmol/L EGCG組比，20、40、80、160、320 μmol/L的EGCG組NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞比率明顯增加，G1/S明顯減少，G2/M起沒有明顯的變化。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG作用NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞24 h可以明顯抑制Cyclin D1、Cyclin E和CDK4/6的表達，并且隨著濃度增大蛋白水平逐漸降低，見圖2。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；B:NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞周期G1/G0、S和G2/M期統(tǒng)計分析；C：Western blot檢測蛋白水平；*：P<0.05，與空白對照組比較

圖2 EGCG抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達

2.3EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響 與0 μmol/L EGCG組比，以20、40、80、160、320 μmol/L的EGCG處理NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞24 h明顯增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量。蛋白免疫印跡實驗證實，EGCG明顯升高NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞的cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9蛋白水平，且呈現(xiàn)劑量依賴性增加，見圖3。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B:Western blot檢測蛋白水平

圖3 EGCG誘導(dǎo)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞

凋亡及相關(guān)蛋白表達

2.4EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞NF-kB/Bcl2信號通路的影響 phospho-p65和Bcl2在EGCG組明顯降低，Bax水平明顯增加，且均呈現(xiàn)劑量依賴性。EGCG通過下調(diào)phospho-p65和下游Bcl2蛋白表達誘導(dǎo)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖4 EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞NF-κB/Bcl-2的影響

2.5EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞EGFR/ERK/AKT信號通路的影響 本研究實驗結(jié)果證明，EGCG抑制EGFR蛋白Tyr845位點磷酸化，同時下調(diào)下游因子phospho-AKT，但phospho-ERK沒有明顯的變化，見圖5。

圖5 EGCG調(diào)節(jié)NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞EGFR/ERK/AKT信號通路

2.6下調(diào)EGFR促進EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 與Control siRNA組相比，EGFR siRNA組EGFR蛋白明顯降低(P<0.05)。同時，EGFR siRNA抑制EGFR蛋白Tyr845位點磷酸化表達后，下游因子phospho-ERK和phospho-AKT亦明顯下調(diào)，見圖6。與EGFR siRNA組比較，EGCG siRNA+EGFR組中EGFR(Tyr845)蛋白的表達明顯更低(P<0.05)，同時，下游phospho-ERK和phospho-AKT亦明顯下調(diào)(P<0.05)。

圖6 下調(diào)EGFR促進EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)

3 討 論

腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的發(fā)生、發(fā)展涉及多種癌基因和抑癌基因表達或功能失常[16]。研究報道：EGFR作為增殖和凋亡調(diào)節(jié)型受體蛋白，參與多種腫瘤的增殖與凋亡的多個環(huán)節(jié)[17-18]。它能降低多種腫瘤細(xì)胞的遷移，同時抑制細(xì)胞增殖[19]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺癌越重，EGFR蛋白表達越高[20]。然而，EGFR的突變與臨床藥物的敏感性降低有關(guān)，這說明EGFR在肺癌的發(fā)生于發(fā)展中具有重要作用[19,21]。同時有報道稱，EGCG可以通過調(diào)節(jié)EGFR的表達影響順鉑等藥物對腫瘤的敏感性。因此，EGCG可能成為新型的治療腫瘤與改善腫瘤耐受性的藥物。

本研究中，借助公認(rèn)的人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975細(xì)胞和人肺鱗狀上皮癌細(xì)胞NCI-H520細(xì)胞，EGCG明顯抑制NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴性和時間依賴性。而且，EGCG明顯升高NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞比率，降低G1/S細(xì)胞比率，同時，EGCG明顯抑制cyclinD1、cyclinE、CDK4/6的表達，繼而影響細(xì)胞的增殖。再者，Annexin V/IP染色法表明：EGCG促進NCI-H520和NCI-H1975凋亡，并且與升高cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9蛋白有關(guān)。

EGFR/AKT/ERK信號通路和NF-kB/Bcl2信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的參與細(xì)胞增殖、凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究中EGCG明顯下調(diào)EGFR/AKT/ERK和NF-kB/Bcl2信號通路相關(guān)蛋白。因此，EGCG的抑制NCI-H1975和NCI-H520細(xì)胞增殖效應(yīng)可能與此兩條信號通路有關(guān)，并且在EGFR siRNA轉(zhuǎn)染后，相比于只用EGFR siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，EGCG可以更加明顯的抑制EGFR/AKT/ERK和NF-kB/Bcl2信號通路相關(guān)蛋白。由此可知，下調(diào)EGFR促進EGCG對NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

綜上所述，EGCG可以通過下調(diào)EGFR/AKT/ERK和NF-kB/Bcl2信號通路促進NCI-H520和NCI-H1975細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖。