轉(zhuǎn)染正常c-CBL基因后耐藥GIST體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)研究*

楊 平，陳 博，賈貴清，伍曉汀，張祥運(yùn)，李 衛(wèi)

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)胃腸外科，成都 610110；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，合肥 246400；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072；4.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院/華西醫(yī)院胃腸外科，成都 610041)

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于胃腸道卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)，是胃腸道最常見的間充質(zhì)源性腫瘤，每年發(fā)病率為10～20/100萬(wàn)人[1-3]。雖然GIST的甲磺酸伊馬替尼分子靶向治療效果較好，但仍然有10%～20%GIST的患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)耐藥及40%～50%發(fā)生繼發(fā)耐藥[4]，且治療期間繼發(fā)耐藥每年遞增10%,但GIST的耐藥機(jī)制不明。近年來(lái)在急性骨髓性白血病研究發(fā)現(xiàn)c-CBL是一種新型泛素連接酶E3，可以負(fù)調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶(RTK)；突變的c-CBL能夠激活其他RTK(如c-Kit)[5-6]。這些成果對(duì)探索有效逆轉(zhuǎn)甲磺酸伊馬替尼耐藥的胃腸道間質(zhì)瘤有較重要的參考意義。因此，本研究將正常c-CBL基因?qū)隚IST耐藥細(xì)胞，觀察在體外甲磺酸伊馬替尼對(duì)耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料 瘤源細(xì)胞來(lái)自1例29歲青年男性患者，診斷為小腸間質(zhì)瘤復(fù)發(fā)伴腹腔轉(zhuǎn)移。腹腔瘤體出現(xiàn)體積增大，有再次手術(shù)指征。

1.1.2主要試劑 中性蛋白酶(Dispase)購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)GBICO公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥公司，C-kit抗體購(gòu)于美國(guó)Snata Curzt公司，c-CBL抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司，甲磺酸伊馬替尼(格列衛(wèi)，Glivec) 購(gòu)于瑞士Novatis公司，攜帶正常c-CbL基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體購(gòu)于中國(guó)大連寶生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heareus公司)，倒置顯微鏡(日本Olmypus公司)，超凈工作臺(tái)(德國(guó)Hearues公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，四唑鹽比色法(MTT)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK)。

1.2方法

1.2.1GIST原代細(xì)胞的獲取、分離和培養(yǎng) 選擇經(jīng)手術(shù)切除后腹腔內(nèi)復(fù)發(fā)的GIST患者(口服甲磺酸伊馬替尼)超過6個(gè)月(400 mg/d),影像學(xué)證實(shí)腹腔瘤體復(fù)發(fā))，有手術(shù)指征。手術(shù)切除的新鮮GIST組織經(jīng)快速病理證實(shí)為梭型細(xì)胞腫瘤，將腫瘤剔除壞死及污染組織，PBS沖洗3次，再用含500 μg/mL慶大霉素、500 μg/mL鏈霉素、500 μg/mL青霉素的無(wú)血清RPMI 1640沖洗，剪碎組織，加入2倍體積的1 mg/mL中性蛋白酶，37 ℃消化60 min，收集單個(gè)及小塊組織的瘤細(xì)胞，離心洗滌2次，收集單個(gè)及小塊組織的瘤細(xì)胞接種于150 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含20%FCS的RPMI-1640/DMEM。次日棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔3 d換液1次。

1.2.2培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%時(shí)觀察細(xì)胞，并在倒置顯微鏡下拍照；細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)：(1)將專用爬片泡酸，三蒸水沖洗及高壓消毒后放入干燥箱備用；(2)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度105/mL，將細(xì)胞接種于含玻片的培養(yǎng)皿中，置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待細(xì)胞爬滿玻片后取出玻片，用PBS沖洗2次；(4)將爬片用95%的乙醇固定15 min后用PBS沖洗2次；(5)PBS清洗標(biāo)本3次各1 min；(6)冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min)；(7)空氣干燥5min后PBS清洗標(biāo)本3次 各 2 min；(8)0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min；(9)PBS清洗標(biāo)本3次各2 min，再3%H2O2(試劑A)孵育15 min；(10)DPBS清洗標(biāo)本3次各2 min；(11)封閉血清孵育(試劑B)20 min；(12)一抗孵育(滴度1∶200，濕盒)4 ℃ 過夜或37 ℃ 60 min，陰性對(duì)照用一抗來(lái)源血清；(13)PBS清洗標(biāo)本3次各5 min；(14)二抗工作液孵育(濕盒試劑C) 37 ℃ 30 min；(15)PBS清洗標(biāo)本3次各5 min；(16)試劑D(濕盒) 37 ℃ 30 min；(17)PBS清洗標(biāo)本3次，各5 min；(18)DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色 ) 3～10 min；(19)蒸餾水洗2次1 min；(20)蘇木素復(fù)染0.5～1.0 min；(21)自來(lái)水洗返藍(lán)；(22)梯度乙醇脫水75、85、95，100%各需3 min；(23)二甲苯透明2次各3 min；(24)中性樹膠封片。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系c-Kit基因的突變位點(diǎn)狀況如下，上游引物：5-CTG GGT CAC TTT GAT ATG GT-3,下游引物：5-AGC CCT GAC CTT CTG ATT C-3。據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書，反應(yīng)體系：模版c-DNA 5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，Sterile water 18 μL，混勻后加入High Fidelity PCR Master 25 μL，混勻。總反應(yīng)總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增在PE2400型PCR儀上進(jìn)行。瓊脂電泳證明擴(kuò)增成功后。選擇PCR base line substrated 模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和修正。以第4至15個(gè)循環(huán)熒光強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，確定不同處理間的CT值，進(jìn)行分析。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染 攜帶有正常c-CBL基因反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染：將第3代耐藥GIST細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，將逆轉(zhuǎn)錄病毒按1∶10病毒滴度，加入到培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4GIST細(xì)胞體外藥物敏感性測(cè)定(MTT法) 常規(guī)用胰酶消化GIST細(xì)胞，離心后棄上清液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種培養(yǎng)。24 h后，加入不同濃度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔并設(shè)對(duì)照孔。分別培養(yǎng)48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT，4 h后每孔加入二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物混勻，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處讀取光密度(A)值。重復(fù)3次。存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，抑制率(%)=(1-存活率)×100%。

2 結(jié) 果

2.1耐甲磺酸伊馬替尼細(xì)胞來(lái)源患者 患者男性，29歲，小腸間質(zhì)瘤復(fù)發(fā)伴腹腔轉(zhuǎn)移。術(shù)后免疫組織化學(xué)：CD117(+)，CD34(+)，S-100(-)，SMA(-)，Desmin(-)，支持小腸間質(zhì)瘤伴腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移。

2.2耐藥GIST原代細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件 在細(xì)胞分離方法上，使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培養(yǎng)方法最容易分離出細(xì)胞，最適合耐藥GIST原代細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是含20%進(jìn)口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。

2.3原代耐藥GIST細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況 剛分離的耐藥原代細(xì)胞大約10 h開始貼壁，48 h伸展開，72 h完全伸展開。原代培養(yǎng)的細(xì)胞第5天起開始增殖，第10天可傳代。耐藥GSIT原代細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈互不重疊的單層，細(xì)胞生長(zhǎng)呈成纖維細(xì)胞狀，為長(zhǎng)梭型(圖1)。傳代1～2代后細(xì)胞生長(zhǎng)加快，3～4 d傳代1次。傳代7～10代后耐藥原代細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞皺縮，后出現(xiàn)衰老、死亡。

圖1 原代耐藥GIST形態(tài)學(xué)(×200)

圖2 細(xì)胞爬片后免疫組織化學(xué)示CD117+(×200)

2.4原代耐藥GIST細(xì)胞生物學(xué)鑒定 細(xì)胞爬片后免疫組織化學(xué)染色鑒定(CD117+)，即胞質(zhì)、胞膜中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物(圖2)，為典型GIST表現(xiàn)。Western Blot 檢測(cè)耐藥GIST的c-kit表達(dá)：Western Blot 檢測(cè)耐藥GIST的c-Kit穩(wěn)定表達(dá)c-Kit蛋白，該細(xì)胞具有典型GIST細(xì)胞特征(圖3)。RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示耐藥GIST細(xì)胞C-kit突變位點(diǎn)位于第9號(hào)外顯子，是編碼丙氨酸和酪氨酸的(502Ala-503Tyr)的6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)插入，導(dǎo)致了GIST發(fā)生，RT-PCR檢測(cè)c-Kit基因突變位點(diǎn)見圖4。

圖3 耐藥GIST細(xì)胞表達(dá)c-kit表達(dá)情況

圖4 耐藥GIST細(xì)胞KIT基因突變位點(diǎn)

2.5耐藥GIST細(xì)胞轉(zhuǎn)染 從熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，1∶10的病毒原液滴度轉(zhuǎn)染耐藥GIST細(xì)胞獲得95%的轉(zhuǎn)染效率(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡結(jié)果(×100)

2.6轉(zhuǎn)染前后耐藥GIST對(duì)不同濃度的甲磺酸伊馬替尼作用 轉(zhuǎn)染前耐藥細(xì)胞在1.60 μmol/L濃度時(shí)，抑制率未超過50%；但轉(zhuǎn)然后，在0.10 μmol/L濃度抑制率達(dá)到(76.50±1.71)%，繼續(xù)增加濃度，抑制率未發(fā)現(xiàn)明顯升高。轉(zhuǎn)染前后不同濃度的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 不同濃度甲磺酸伊馬替尼對(duì)轉(zhuǎn)染前后耐藥GIST作用72 h的抑制率%)

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)少見成熟的耐藥GIST細(xì)胞株出售，國(guó)外已經(jīng)建立的GIST細(xì)胞株有GIST780、GIST-T1、GIST48、GIST882,、GIST430[7-9]。GIST882是經(jīng)典的敏感細(xì)胞，對(duì)甲磺酸伊馬替尼高度敏感，但是體外不易培養(yǎng)[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)原代培養(yǎng)后，耐藥GIST 細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下呈團(tuán)塊樣生長(zhǎng)，可見核分裂象，細(xì)胞核型為多倍體。在細(xì)胞分離方法上，本研究發(fā)現(xiàn)使用1 mg/mL中性蛋白酶消化培養(yǎng)的方法最容易分離出細(xì)胞，GIST細(xì)胞也最容易爬出。1%胰酶消化法分離的細(xì)胞數(shù)少，細(xì)胞存活率低。而組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞很難爬出。最適合耐藥GSIT原代細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是含20%進(jìn)口的GBICO公司的CFS的RPMI-1640。 同時(shí)耐藥GIST細(xì)胞在傳代7～10代后細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞皺縮，后出現(xiàn)衰老、死亡。所選標(biāo)本術(shù)后組織DNA 測(cè)序均提示C-kit 基因第9 外顯子病理性突變，培養(yǎng)耐藥細(xì)胞爬片，Western Blot檢測(cè)顯示為所培養(yǎng)耐藥細(xì)胞CD117+，耐藥細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)C-kit蛋白，因此表明經(jīng)培養(yǎng)后原代耐藥GIST保留了人GIST耐藥細(xì)胞的生物特性。

本研究甲磺酸伊馬替尼對(duì)GIST細(xì)胞作用72 h的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染前耐藥細(xì)胞在1.60 μmol/L濃度時(shí)，抑制率未超過50%；然而轉(zhuǎn)然后，在0.10 μmol/L濃度抑制率達(dá)到76.5%，繼續(xù)增加濃度，抑制率未發(fā)現(xiàn)明顯升高。提示轉(zhuǎn)然正常c-CBL后的細(xì)胞對(duì)甲磺酸伊馬替尼敏感。本研究證實(shí)了在耐藥GIST中轉(zhuǎn)染了正常c-CBL基因后，提高了對(duì)甲磺酸伊馬替尼的敏感性，這說(shuō)明正常的c-CBL在間質(zhì)瘤中可能起著抑癌基因的作用。c-CBL這種作用與RATHINAM等[6]在慢性髓樣細(xì)胞白血病類似。

但是c-CBL基因是如何參與調(diào)控GIST細(xì)胞增殖、分化，其機(jī)制目前不清楚。在白血病細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)c-CBL能和PI3K的p85亞基的相互作用，促使PI3K泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解[11-12]，提示其能負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路。有研究提示c-CBL通過泛素結(jié)合酶與受體酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致其泛素化及降解，而負(fù)調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體，影響其蛋白表達(dá)水平[13]。本研究是初次從宏觀探索c-CBL其在耐藥GIST的作用，轉(zhuǎn)染正常c-CBL后的耐藥細(xì)胞對(duì)甲磺酸伊馬替尼敏感性有所提升，但其機(jī)制不清楚，有待下一步研究繼續(xù)深入。