華蟾素對人胃癌SGC7901細胞增殖及Rho GTPase表達的影響*

李楠靜，黃 娟，張 又，何 菲

(1．成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610072；2.四川省人民醫院血液科，成都 610072； 3．四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室，成都610041)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國發病率和病死率較高。目前除了化療等傳統治療手段以外，也在探索中西醫結合的腫瘤綜合治療方案。華蟾素是從傳統中藥材蟾皮中提取的生物制劑，具有清熱解毒、消腫化瘀等功效，多項研究發現其具有較強的抗腫瘤作用[1-2]。Rho GTPases是重要的細胞內信號分子，參與調控許多細胞生理進程，Rho家族在腫瘤細胞中通常呈高表達，幾乎參與了腫瘤發生、發展的每一個重要環節，RhoA、Cdc42和Rac1是其中最受關注的分子[3-4]。本實驗通過華蟾素對胃癌SGC7901細胞增殖能力和細胞內Rho GTPases(RhoA、Cdc42、Rac1)表達的影響，為胃癌的綜合治療提供新的理論依據和選擇方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細胞系SGC7901(四川大學信號轉導及分子靶向治療實驗室提供)；華蟾素(每支5 mL，安徽華潤金蟾藥業股份有限公司)；鼠抗人RhoA、Cdc42、Rac1、β-actin單克隆抗體(美國BD公司)；RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；lipofectamineTM2000、Trizol(美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 胃癌細胞系SGC7901由RPMI 1640 (含10%胎牛血清)， 37 ℃、5%CO2敷箱常規培養。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 培養胃癌細胞系SGC7901細胞至對數生長期，按照每孔2×103密度接種于96孔板,培養24 h細胞貼壁后加入華蟾素，使其最終濃度達到0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，每個實驗組設3個復孔,并設對照組。分別于藥物培養24、48、72 h進行檢測。檢測時更換為100 μL新鮮培養液與10 μL CCK-8試劑混合繼續孵育4 h，用酶標儀讀取吸光度(A)值,選擇490 nm和630 nm雙波長,增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3Western blot檢測RhoA、Cdc42、Rac1蛋白的表達 收集3種濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)華蟾素培養48 h后的SGC7901細胞，制備細胞總蛋白，BCA方法進行蛋白質定量。取等量的蛋白樣品行12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,并將蛋白轉移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入RhoA、Cdc42、Rac1抗體4 ℃搖床孵育過夜,加入熒光二抗避光于室溫振搖2 h，將膜直接置于紅外熒光掃描儀中掃描，與內參照β-actin進行比較。

1.2.4RT-PCR檢測RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA的表達 收集3種濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)華蟾素培養48 h后的SGC7901細胞，以Trizol試劑提取總RNA，按照PCR試劑盒說明書方法反轉錄獲得cDNA。按表1引物進行RT-PCR擴增，PCR反應條件為95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s，共36個循環，最后1個循環72 ℃延伸5 min,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠圖象分析儀進行條帶分析。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 結 果

2.1華蟾素對SGC7901細胞增殖活性的影響 隨著華蟾素濃度的增加和作用時間的延長，其對SGC7901細胞增殖抑制作用也在逐漸增強，呈劑量及時間效應關系，各濃度華蟾素組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 華蟾素對SGC7901細胞增殖的影響

a：P<0.05,與對照組比較

2.2華蟾素對SGC7901細胞RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達的影響 隨著藥物濃度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達水平逐漸降低，呈現劑量依賴性，當劑量達到2.0 mg/mL的時候蛋白表達量最低，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測各組SGC7901細胞中RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表達

2.3華蟾素對SGC7901細胞RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達的影響 隨著藥物濃度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達量逐漸降低，顯示出劑量依賴性，各濃度華蟾素組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 華蟾素對SGC7901細胞中RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達的影響

a：P<0.05,與對照組比較

3 討 論

胃癌是最常見的惡性腫瘤，是世界上第2大癌癥死因。我國是胃癌高發區，其發病率和病死率高居各種惡性腫瘤之首，嚴重威脅著人們的健康和生命，胃癌目前臨床上主要采用以5-FU為基礎的化療方案[5]，然而胃癌5年相對生存期仍然很低，探索新的有效抗腫瘤成分的藥物和對相關的信號轉導通路的影響成為近年來腫瘤研究的重點。華蟾素是以中華大蟾蜍皮為主要原料制成的一種水溶性制劑,具有清熱解毒，消腫化瘀等作用。研究發現華蟾素對肝癌、胰腺癌、結腸癌、骨肉瘤、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長和增殖有較強的抑制作用，能夠誘導腫瘤細胞的分化和促進凋亡，逆轉多藥耐藥性[6-9]。

Rho GTPases家族均有與GTP結合的基因序列，與GDP和GTP有很高的親和力，能夠接收多種刺激信號。Rho家族是細胞內重要的信號分子，可以參與調控細胞骨架重組、細胞黏附和移動、細胞周期、細胞凋亡、細胞分裂、基因轉錄等多種生理過程[10]。作為Rho家族研究最多最具代表性的3個分子，大量的基礎實驗研究發現RhoA、Cdc42、Rac1與腫瘤的發生、發展有重要的聯系，可以促進細胞分裂，加速細胞的生長、增殖；促進腫瘤血管壁的發育，加速腫瘤血管的生成；能夠對抗和阻斷細胞的凋亡信號轉導途徑從而抑制細胞的凋亡[11-13]。目前多個研究發現RhoA、Cdc42、Rac1在胃癌細胞和組織中呈現高表達[14-15]，本實驗希望通過研究不同濃度華蟾素對胃癌細胞中RhoA、Cdc42、Rac1基因表達的影響，探討華蟾素通過Rho GTPases信號通路抗胃癌的作用機制。

本實驗首先采用CCK-8法檢測4種(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)不同濃度華蟾素作用于SGC7901細胞24、48、72 h后的增殖活性，顯示各實驗組與對照組相比增殖活性受到明顯抑制，0.5 mg/mL濃度的華蟾素對SGC7901細胞即有抑制作用，2.0 mg/mL濃度的華蟾素在72 h時抑制率為最高，增殖抑制率呈現出劑量和時間依賴性關系。細胞增殖抑制實驗得到的有效濃度范圍中，選擇3種(0.5、1.0、2.0 mg/mL)不同濃度華蟾素，用Western blot和RT-PCR分別檢測其作用于SGC7901細胞48 h后RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和基因表達，顯示RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和mRNA表達水平均較對照組降低，且隨著華蟾素濃度的增加，3種分子的蛋白和mRNA表達量逐漸降低，2.0 mg/mL濃度的華蟾素抑制蛋白和mRNA表達作用最強，呈現劑量依賴性。表明華蟾素可以降低胃癌SGC7901細胞中Rho GTPase的表達，通過抑制Rho家族信號轉導通路中相關分子的表達來降低細胞的增殖能力，從而起到抗腫瘤的作用。本實驗為華蟾素抗胃癌的作用機制提供新的研究方向，為其臨床應用提供理論依據。