Pam3Csk4預處理對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染小鼠腎膿腫影響研究*

陳益國,鄧林強,陳 會,熊章華,桂曉美,曾黎峰,喻金梅

(1.江西省人民醫院檢驗科，南昌 330008；2.江西省婦幼保健院腫瘤科 南昌330006)

金黃色葡萄球菌是院內感染率較高的細菌之一，自上世紀60年代檢出第1株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以來，其分離率已逐年上升，目前MRSA已由院內感染擴展到社區[1-2]，自2002年以來，耐萬古霉素金黃色葡萄球菌分離逐年增加[3]，使臨床用藥面臨嚴峻考驗[4]。因此，尋找免疫學治療和預防金黃色葡萄球菌感染已成為人們關注的焦點， TLR2受體是機體免疫系統識別革蘭陽性細菌的主要模式識別受體。本課題組前期研究表明，TLR2受體合成配基Pam3Csk4預處理小鼠能顯著降低MRSA小鼠肺炎模型的病死率，并在體外能增強巨噬細胞和中性粒細胞的殺菌功能[5-6]，提示Pam3Csk4能增強感染動物對金黃色葡萄球菌的抵抗能力，由于金黃色葡萄球菌血流感染后，臟器膿腫是常見并發癥之一，所形成膿腫可源源不斷地提供感染源，是金黃色葡萄球菌感染久治不愈的常見原因之一。因此本研究擬用亞致死劑量的MRSA進行小鼠造模，探索Pam3Csk4對金黃色葡萄球菌感染后對腎臟的保護功能。

1 材料與方法

1.1材料 18～22 g的SPF級昆明(KM)小鼠購自于江西省中醫藥大學實驗動物中心；MRSA標準菌株 (MRSA，ATCC43300)于本室保存；PE/CY5.5-anti- Gr-1,PE-anti-CD11b 來源于biolegend公司(美國)，膠原酶Ⅰ和DNAse來源于美國sigma公司，RT-PCR和Q-PCR擴增試劑盒購自TaKaRa公司(日本)，其余試劑均為國產分析純。Beckman低溫冷凍高速離心機、CO2恒溫細菌培養箱和 Q-PCR儀(CFX96)由江西省人民醫院中心實驗室提供。

1.2方法

1.2.1引物合成 由上海英韋創津公司合成下列引物序列，見表1。

1.2.2MRSA制備 將MRSA轉種于血瓊脂平板，18～24 h后挑選單個菌落移種于LB培養繼續培養4～6 h到對數期，4 ℃ 6 000×g離心10 min,留取沉淀，無菌pH 7.4 PBS洗5次后重懸，細菌數按照文獻[6]計算后備用。

1.2.3腎膿腫模型 MRSA菌懸液制備同前，將所得菌懸液稀釋至每100 μL含1×108CFU MRSA，尾靜脈注射每只100 μL，Pam3Csk4預處理劑量每只50 μg，注射體積每只100 μL，每組動物4只，3、7 d后斷頸處死并收集腎臟觀察小鼠膿腫腎個數和切片作HE染色，觀察膿腫大小和數量、WBC浸潤情況。

1.2.4腎臟中性粒細胞浸潤流式檢測 將小鼠分為未處理正常小鼠組、生理鹽水組和Pam3Csk4處理組共3組，每組4只，Pam3Csk4處理組按每只50 μg尾靜脈注射Pam3Csk4，生理鹽水組注射體積每只100 μL生理鹽水。除未處理正常小鼠組外，Pam3Csk4或生理鹽水處理24 h后以每只1×108CFU的MRSA 尾靜脈攻擊，攻擊小鼠攻擊12 h后斷頸處死并摘取左腎，勻漿，胰酶消化，腎中性粒細胞制備按文獻[5]方法進行，即用10 U/mL膠原酶Ⅰ和2 μg /mL的DNAs消化30 min，離心收集細胞后加入進行PE/CY5.5 Gr-1和PE-anti-CD11b室溫孵育30 min后，1×PBS洗3次，4%多聚甲醛固定后檢測。

1.2.5腎組織PCR 將雌性20～22 g SPF級的KM小鼠分成組，每組動物4只，Pam3Csk4預處理劑量每只50 μg。 MRSA亞致死量感染細菌量為每只1×108CFU，尾靜脈注射。攻擊小鼠6、12 h后斷頸處死并摘取左腎、勻漿。Q-PCR按參考文獻[7]略有改動進行，按TaKaRa試劑盒提取總RNA，反轉錄后進行Q-PCR；反轉錄條件按TakaRa提供方法進行；Q-PCR：95 ℃變性5 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35～40個循環。

表1 cDNA序列

2 結 果

2.1Pam3Csk4預處理抑制MRSA導致的腎膿腫 Pam3Csk4預處理小鼠感染MRSA后，膿腫主要在集中于腎臟，MRSA感染3、7 d Pam3Csk4處理組膿腫腎數量少于生理鹽水組(P<0.05)，見表2，圖1箭頭所示白色部分為腎膿腫，生理鹽水組7 d內1只小鼠出現死亡，其余腎臟已變形且膿腫較為明顯，切片結果顯示Pam3Csk4處理組腎膿腫的病變程度明顯減輕低于生理鹽水組(切片均來源于左腎)，見圖2。肝組織未見肉眼可見膿腫，切片也少見膿腫跡象。

表2 MRSA感染后的膿腫腎個數(個)

A:生理鹽水組3 d；B:Pam3Csk4處理組3 d；C:生理鹽水組7 d；D:Pam3Csk4處理組7 d

圖1 Pam3Csk4預處理抑制MRSA導致的腎膿腫大體觀

A:正常小鼠組；B:Pam3Csk4處理組3 d；C:Pam3Csk4處理組7 d；D:生理鹽水組3 d;E生理鹽水組7 d

圖2 Pam3Csk4預處理抑制MRSA導致的腎膿腫切片(HE×200)

2.2Pam3Csk4預處理抑制中性粒細胞的浸潤 流式結果顯示，MRSA感染后12 h，Pam3Csk4處理組小鼠腎組織中性粒細胞浸潤為1.5%，低于生理鹽水組(3.7%)，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

2.3Pam3Csk4預處理抑制小鼠腎臟CXCL1/2 mRNA的表達 Pam3Csk4預處理后CXCL1/2顯著增強(P<0.01)，但MRSA感染6 h和12 h后，Pam3Csk4處理組小鼠CXCL1/2表達均低于生理鹽水組(P<0.01)，見圖4。

A:中性粒細胞值；B:正常小鼠組；C:Pam3Csk4處理組；D:生理鹽水組；b:P<0.01

圖3 Pam3Csk4預處理抑制中性粒細胞的浸潤

A：MRSA感染后6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05，b：P<0.01

圖4 MRSA感染后小鼠腎臟CXCL1/2基因表達

2.4Pam3Csk4預處理降低MRSA感染后腎臟炎癥介質的釋放 在感染后不同時間點，Pam3Csk4預處理顯著限制感染小鼠炎癥介質TNF-α、 IL-1β和 IL-6而促進抗炎因子IL-10基因表達，見圖5。

2.5Pam3Csk4預處理降低小鼠腎組織HGMP1和HSP70基因表達 Pam3Csk4預處理小鼠在MRSA感染6 h內與生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但12 h能顯著降低HSP70和HGMP1的基因表達，見圖6。

2.6Pam3Csk4預處理增強小鼠腎組織FcγRⅢ和CR3基因表達 在6、12 h時間點Pam3Csk4處理組CR3和FcγRⅢ均顯著高于生理鹽水組，而CR3在感染后6 h Pam3Csk4處理組與生理鹽水組間差異無統計學意義(P>0.05)，在感染12 h后Pam3Csk4處理組顯著高于生理鹽水組，見圖7。

A：MRSA感染后 6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05；b:P<0.01

圖5 MRSA感染后腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA表達

A：MRSA感染后 6 h；B：MRSA感染后12 h；a：P<0.05

圖6 Pam3Csk4預處理降低小鼠腎臟HGMP1和HSP70的表達

A：MRSA感染后 6 h ； B：MRSA感染后12 h；a：P<0.01

圖7 Pam3Csk4預處理增強FCr R Ⅲ和CR3的表達

3 討 論

金黃色葡萄球菌血流感染后，臟器膿腫是常見并發癥之一,所形成膿腫可源源不斷地提供感染源，是金黃色葡萄球菌慢性感染久治不愈的常見原因之一，因此本研究探索Pam3Csk4是否能抑制金黃色葡萄球菌內臟膿腫的形成；本研究結果顯示，MRSA感染小鼠，肝組織未見肉眼可見膿腫，切片也少見膿腫跡象，Pam3Csk4預處理后，膿腫主要集中于腎臟，MRSA感染3 d和7 d的結果顯示，Pam3Csk4處理組腎臟膿腫數量顯著減少，切片結果顯示其腎膿腫的病變程度明顯減輕低于生理鹽水處理組。

中性粒細胞是天然抗感染免疫的一線細胞[7]，當金黃色葡萄球菌侵入機體后，中性粒細胞快速聚集到感染部位，從而發揮抗感染作用，但過度的中性粒細胞浸潤也會導致不同程度組織損傷和過度炎性反應[8]。另一方面，中性粒細胞刪除的小鼠也能顯著降低其細菌清除率和感染動物的存活時間[9]，因此適當控制中性粒細胞的浸潤具有重要意義。與以往研究[10]一致,本研究結果表明,預處理Pam3Csk4減少MRSA感染小鼠腎臟中性粒細胞浸潤。進一步研究表明,這種現象可能與降低中性粒細胞趨化因子CXCL1/2及細胞表面趨化性受體表達有關，其機制可能通過限制機體中性粒細胞的浸潤而抑制因過度中性粒細胞聚集而導致的過度炎性反應[11]。本課題組前期已發表數據顯示，Pam3CSK4鼻腔滴注也能顯著降低MRSA感染后肺部中性粒細胞的浸潤[5]，但如何控制中性粒細胞的聚集量目前仍然是亟待解決的問題。

對于感染患者來說，過度的炎性反應往往是其死亡的重要因素[12]，因此本研究對小鼠感染后腎臟炎癥介質的基因表達進行了檢測，結果發現，Pam3Csk4的預處理能抑制MRSA感染小鼠腎組織促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，并且提高抗炎癥因子IL-10的釋放，提示Pam3Csk4預處理能抑制MRSA感染導致的過度炎性反應。

HGMP1和HSP70反應急性腎腎損傷的重要炎癥指標，HGMP1和HSP70的表達增加能增加腎臟的炎性反應和腎細胞的急性損傷[13]。本研究表明，Pam3Csk4預處理小鼠在金黃色葡萄球菌感染6 h內與對照組比較無顯著變化，但能顯著降低12 h后HGMP1和HSP70的mRNA表達，提示Pam3Csk4能降低金黃色葡萄球菌感染小鼠腎臟的炎性反應。

調理吞噬是機體抗菌免疫重要機制，其中調理性Fcγ受體分為3類[14]，通過結合不同的IgG亞型發揮調理吞噬作用，有研究報道TLR2激動劑處理能增強外周血單核細胞釋放細胞因子和體外抗菌能力[15]。本研究結果表明,Pam3Csk4預處理能增強MRSA感染后腎FCγRⅢ基因表達，但單獨Pam3Csk4預處理后其表達水平增加不明顯，其潛在機制尚不明確。補體受體為另一類調理吞噬性受體,可通過結合與細菌結合的C3b和iC3b而發揮補體參與的殺菌作用，文獻研究表明，機體感染病原微生物后補體受體的表達水平增加[15]。因此，本研究也檢測腎組織中補體受體的表達，結果表明，Pam3Csk4預處理也能顯著增強CR3的表達。結合上述研究結果提示，Pam3Csk4預處理增強的細菌清除率可能與增強腎組織免疫細胞表面調理吞噬性受體表達、抑或是增強中性粒細胞等免疫細胞氧化應激、殺菌性蛋白的釋放有關[5]。

綜上所述，Pam3Csk4預處理能顯著降低MRSA導致腎膿腫，同時抑制因MRSA感染所導致的過度炎性反應，降低腎損傷程度，該現象并非增加PMN等免疫細胞數量，可能與增強腎組織浸潤的免疫細胞的吞噬功能相關。