開菲爾粒中干酪乳桿菌的分離鑒定及發酵性能分析

鞏小芬，嚴琪鈺，王雨童，王江月，高恩燕，張恩鵬，劉朋龍，王亮

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013，2.新疆天潤生物科技股份有限公司，烏魯木齊830088）

0 引 言

干酪乳桿菌最初是由日本學者從健康人體腸道中分離，是國際上公認的益生菌，早在2001年就被我國衛生部列為可食用菌種[1]。研究表明干酪乳桿菌發酵乳能夠維持腸道益生菌群多樣性[4]，改善便秘[5]、提高人體免疫力[6]，治療遲發型超敏反應[7]。目前我國在優良干酪乳桿菌選育方面的文獻報道較少，市場缺乏具有自主知識產權干酪乳桿菌，因此開展野生干酪乳桿菌的分離鑒定及選育具有重要的意義。開菲爾粒[8]

是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等菌種組成的共生體系，干酪乳桿菌是開菲爾粒中的優勢菌種[9,10]。本研究以新疆不同地區來源的開菲爾粒為分離源，分離鑒定干酪乳桿菌，并通過對其發酵性能的分析進行逐級篩選，以期為益生菌發酵乳的生產提供優質干酪乳桿菌。

1 實驗

1.1 材料與試劑

材料：開菲爾粒，采集于新疆烏魯木齊、喀什、伊犁等地區；生牛乳，本地農戶采集。

試劑：瓊脂糖，引物，LA酶M ix，溴化乙錠，TE緩沖液，細菌DNA提取試劑盒；鄰苯二甲醛；鄰苯二胺，亮氨酸，雙乙酰；MRS培養基；LC培養基。

1.2 儀器與設備

541 8R小型高速離心機，PCR儀，瓊脂糖凝膠電泳儀，N i全自動正置熒光顯微鏡，UV-1601紫外分光光度計，Syngene GeneGenius凝膠成像系統，H-1580R高速冷凍離心機，HP6890/5973氣相色譜-質譜聯用儀，SPMC-57328頂空固相微萃取，TA.XT plus質構儀。

1.3 方法

1.3.1 開菲爾粒的活化

將采集的開菲爾粒濾去培養液，無菌生理鹽水沖洗干凈，以質量濃度為50 g/L的接種量接種于95℃（30 min）滅菌的脫脂乳中[11]，轉速為140 r/m in，28℃培養24 h。循環培養6次至pH值穩定[12]。

1.3.2 稀釋液的制備

取上述pH值穩定的開菲爾培養液5 m L注入45 m L滅菌生理鹽水中，同時將活化后的一粒開菲爾粒（約1cm3）經無菌研磨后置入滅菌生理鹽水；溶液加入玻璃珠并用旋渦混勻器將充分混勻，制成初次稀釋液。取初次稀釋液1 m L注入9 m L滅菌生理鹽水中，用吸管反復吹打，使菌體分布均勻。重復上述操作步驟，直至稀釋倍數達到105～107，作為菌種接種液備用[13]。

1.3.3 干酪乳桿菌的分離

將上述接種液涂布于LC培養基，27℃厭氧培養72 h[14]，鏡檢后挑取革蘭氏染色陽性、過氧化氫陰性的桿狀細菌菌落轉接到M RS固體培養基，37℃培養72 h。選擇白色圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、中間凸起的菌落作為實驗目標菌落。

1.3.4 干酪乳桿菌的分子生物學鑒定

將目標菌落擴培，用Ezup柱式細菌基因組抽提試劑盒提取其總DNA。對提取的DNA進行16S rDNA PCR擴增。引物為細菌通用引物：27F(agagtttgatcctggctcag)；1492R(tacggctaccttgttacgactt)。PCR反應條件如表1所示。

表1 PCR反應條件

PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，選擇M arker基因1500bp位置有清晰條帶的待測菌株擴增產物送生物公司進行基因測序。將基因測序結果在Genbank檢索系統，進行基因序列BLAST比對和同源性分析，軟件M EGA 5.10構建系統發育進化樹。

1.3.5 發酵乳的制備

生牛乳→滅菌→冷卻→添加7%蔗糖→接種3%待測菌種接種液→37℃靜置培養至凝乳→4℃后熟24 h→發酵性能指標測定。

1.3.6 干酪乳桿菌的初篩

1.3.6.1 發酵乳酸度及活菌數測定

參照國標GB5413.34-2010和GB4789.35-2016規定的檢測方法，測定發酵乳酸度及活菌數。

1.3.6.2 持水力測定

取10 g發酵乳，4℃條件下，轉速為10 000 r/m in離心20 min，上清液稱重。發酵乳4℃貯藏0，7，14，21 d測定其持水力數值變化。持水力為

式中；W1為上清液質量；W2為樣品質量。

1.3.7 干酪乳桿菌的復篩

實驗以發酵乳中乙醛[15]、雙乙酰[16]、氨基氮[17-18]質量濃度作為評價指標，對初篩選定的干酪乳桿菌進行發酵性能評估，進一步篩選優質干酪乳桿菌菌株。

1.3.8 干酪乳桿菌的第三次篩選

1.3.8.1 干酪乳桿菌發酵乳質構特性的測定

發酵乳質構特性包括硬度、稠度、凝聚性、黏性指數等指標，實驗選用質構儀對干酪乳桿菌發酵乳進行測定[19]。測定條件如表2所示。

表2 發酵乳質構特性測定條件

1.3.8.2 干酪乳桿菌發酵乳揮發性香氣成分測定

實驗采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法（SPM E-GC-M S）測定[20]。

GC條件：程序升溫方式，由常溫升至40℃，40℃保持2.5 min，后以5℃/m in升溫速率至200℃，再以10℃/m in速率升至230℃，230℃保持5 min。進樣口溫度250℃；傳輸線溫度230℃；載氣為He氣，流速1.0m L/m in；不分流進樣。

M S條件：電離方式EI，70 eV；離子源溫度為230℃，質量掃描范圍35～400 am u；發射電流100μA，檢測電壓1.4 kV。

1.3.8.3 干酪乳桿菌發酵乳感官評價

針對不同干酪乳桿菌的發酵乳，邀請具有專業經驗的20名人員，進行感官評定分析，評價標準[12]見表3。

1.4 數據處理

每個實驗重復3次，實驗結果取三次的平均值，數據采用SPSS 19.0進行統計分析，Excel2010作圖。

2 結果與分析

2.1 干酪乳桿菌形態學鑒定

分離得到15株乳酸菌，其菌落均為白色圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、菌體形狀為短桿狀，革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性，鏡檢后初步判定為干酪乳桿菌，形態特征如圖1所示。

圖1中，圖A為目標菌在LC培養基菌落形態圖；圖B為目標菌在M RS培養基形態圖；圖C為目標菌革蘭氏染色圖400×。

表3 感官評定細則

圖1 目標菌形態特征

2.2 干酪乳桿菌分子生物學鑒定

15株乳酸菌DNA PCR擴增，擴增產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示，目標菌DNA擴增條帶均在1400～1600bp之間，與干酪乳桿菌DNA通用引物PCR擴增結果相同，說明15株乳酸菌擴增成功，可用于序列測定。

圖2 16S rDNA片段PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

圖3 15株干酪乳桿菌系統發育樹

將15株乳酸菌測序結果與GenBank中已知序列進行基因BLAST比對，15株菌與Lactobacillus casei strain HS4（KU 587808.1）的親緣關系較近，基因序列同源性均達到100%，因此15株菌確定為干酪乳桿菌。系統發育樹構建如圖3所示。

2.3 優良干酪乳桿菌菌株的篩選

2.3.1 優良干酪乳桿菌的初篩

2.3.1.1 發酵乳酸度及活菌數測定

酸度是影響發酵乳品質的最重要因素，酸度70～110°T為最佳。發酵乳的酸度及活菌數測定結果如表4所示。由表4可以看出，干酪乳桿菌菌株M LC 2，YLC 1，TLC 1，FLC 1的發酵乳；其酸度均超過110°T，嚴重影響了發酵乳的品質。其余11株干酪乳桿菌發酵乳的酸度范圍均在最佳酸度范圍之內，實際酸度測定結果為82.01～101.17°T。15種干酪乳桿菌發酵乳的活菌數均達到了108m L-1，均符合國標對發酵乳中最低活菌數的規定（106m L-1）。

2.3.1.2 發酵乳持水力的測定

持水力同樣也是發酵乳品質的一個重要評價指標。持水力與發酵乳的粘度成正比，胞外多糖產量高的菌株粘度高，持水力強；發酵乳持水力過低或貯藏期間持水力下降會導致乳清析出，從而直接影響發酵乳的組織狀態與口感[21]。圖4顯示，除M LC 2，XLC 1，TLC 1，TLC 2，FLC 1外，剩余10株菌的發酵乳在21天貯藏期內持水力均無顯著性降低且保持在50%以上，優于高微娟[22]、張睿[23]的文獻報道，說明持水力較好，可用于發酵乳制品的生產[22]。

圖4中，a,b,c,d字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。綜合發酵乳酸度、活菌數以及貯藏期間持水力變化三個指標，9株干酪乳桿菌發酵乳酸度在最佳酸度范圍內，活菌數符合國標要求，持水力較高且貯藏期間穩定，因此選擇這9株干酪乳桿菌SLC 1，SLC 2，M LC 1，XLC 2，YLC 2，KLC 1，KLC 2，N LC 1，FLC 2用于后續發酵性能的研究。

表4 發酵乳的酸度及活菌數測定結果

圖4 發酵乳貯藏期間持水力變化

2.3.2 優良干酪乳桿菌的復篩

2.3.2.1 乙醛、雙乙酰質量濃度測定

乙醛、雙乙酰是發酵乳香氣成分兩個最重要的評價指標，研究表明[24]發酵乳中乙醛和雙乙酰質量濃度分別達到5 m g·L-1和1 m g·L-1時，發酵乳呈現出特有的香味。乙醛質量濃度在5～21 m g·L-1范圍內，質量濃度越高發酵乳風味越好[25]；然而當發酵乳中乙醛質量濃度超過30 m g·L-1時會產生令人不愉的氣味，同時雙乙酰質量濃度過高也會使發酵乳風味不佳[24]。乙醛、雙乙酰質量濃度在最佳濃度范圍內，乙醛與雙乙酰比例大于3:1時，比例越大發酵乳風味越優[26]。圖5表明，除N LC 1外，有8株發酵菌發酵乳乙醛與雙乙酰的質量濃度比例均大于3:1，其中4株干酪乳桿菌SLC 1、XLC 2、KLC 1、KLC 2發酵乳乙醛質量濃度均在5～21 m g·L-1范圍內，說明這4株菌具有較好的產香能力。

圖5 乙醛、雙乙酰質量濃度

2.3.2.2 氨基氮質量濃度測定

氨基氮質量濃度是衡量發酵乳營養成分重要指標，直接反映了發酵乳中小分子肽和游離氨基酸的質量濃度，質量濃度越高，表明發酵乳營養成分越易于被人體吸收，同時也間接影響發酵乳的口感和風味[27]。由圖6可以看出，9株干酪乳桿菌中，4株菌SLC 1，XLC 2，KLC 1，KLC 2發酵乳的氨基氮質量濃度為621.40～684.90 mg/L，遠優于傳統乳酸菌發酵乳的氨基氮質量濃度409.50 m g·L-1[27]，也優于藥璐等人將傳統乳酸菌發酵劑與干酪乳桿菌混合發酵的發酵乳氨基氮質量濃度500.88 mg/L[28]，表明上述4株干酪乳桿菌具有較強的乳蛋白分解能力。而其余5株干酪乳桿菌SLC 2，M LC 1，YLC 2，N LC 1，FLC 2發酵乳氨基氮質量濃度為390.40～497.40 m g/L，蛋白質分解能力雖與文獻報道[27-28]的菌株相近，但低于最優的4株干酪乳桿菌分離菌株，這種蛋白質分解能力的差異，可能源于菌株的來源、生長環境不同，從而菌株產生的蛋白酶活力或濃度不同造成的。

圖6 氨基氮質量濃度

4株干酪乳桿菌SLC 1，XLC 2，KLC 1，KLC 2發酵乳在主要風味成分乙醛、雙乙酰質量濃度以及氨基氮質量濃度方面指標較好，因此選取以上4株干酪乳桿菌進行發酵乳質構測定及揮發性香氣成分分析。

2.3.3 優質干酪乳桿菌第三次篩選

2.3.3.1 發酵乳質構特性測定

利用質構儀可以對發酵乳的硬度、稠度、凝聚性及黏性指數等指標進行量化性的測定，測定結果具有較高的靈敏度、客觀性及可比性。四種發酵乳的質構特性如表5所示，可以看出，4種發酵乳的硬度無顯著差異（P＞0.05），均處于發酵乳較佳的硬度范圍[29]33.9～39.9 g，這個范圍的發酵乳硬度最容易為消費者所接受。KLC 2的稠度顯著高于另外三種，說明該菌株發酵過程中產胞外多糖少，發酵乳爽滑性和細膩度較差[30-31]。菌株SLC 1和KLC 1發酵乳的凝聚性與黏性指數均高于XLC 2與KLC 2，差異顯著（P＜0.05），表明SLC 1與KLC 1產胞外多糖較多、凝膠網絡結構較好[29]，從而判定這兩株菌的發酵乳在質構方面優于XLC 2與KLC 2。

表5 不同發酵乳的質構特性

2.3.3.2 發酵乳揮發性香氣成分分析

揮發性香氣成分是影響發酵乳風味重要因素之一，香氣成分豐富[32]與否在一定程度上決定發酵乳的風味優劣。王偉君[33]等人報道發酵乳中主要的揮發性成分有酸類、酮類、醛類、酯類、醇類五種。干酪乳桿菌發酵乳的揮發性香氣成分測定結果如表6所示，4種發酵乳揮發性香氣成分除常見的5種物質成分外，還有烯烴類。

揮發性酸的種類影響發酵乳的爽口感，干酪乳桿菌SLC 1、XLC 2的發酵乳均含有四種酸，比KLC 1、KLC 2豐富。酮類賦予發酵乳濃郁的奶香味和黃油味，使發酵乳整體風味豐滿。4株干酪乳桿菌發酵乳中，SLC 1酮類物質相對質量分數高、種類多，共檢測出七種酮類物質，其余3株干酪乳桿菌發酵乳最多檢測出4種（XLC 2、KLC 2四種，KLC 1三種），說明菌株SLC 1比其他3株干酪乳桿菌發酵乳酮類物質種類更豐富。醛類物質是發酵乳中非常重要的風味物質，其感知閾值較低。由表6可以看出，4株干酪乳桿菌發酵乳中醛類物質相對質量分數都達到了10%以上，其中干酪乳桿菌SLC 1、KLC 1發酵乳中醛類物質種類較豐富，均含有乙醛、2-甲基丁醛、苯甲醛三種醛類，優于XLC 2與KLC 2。酯類物質感知閾值較低，大都表現出果香味。由表6可知，4株干酪乳桿菌發酵乳中所含酯類的種類差別很大，SLC 1發酵乳所含酯類種類較多，相對質量分數較高，優于XLC 2、KLC 1、KLC 2。發酵乳中的醇類主要來源于糖類、氨基酸以及醛類的還原反應。干酪乳桿菌體內含有的乙醛脫氫酶能將乙醛轉化為乙醇，乙醇具有特殊的、令人愉快的酒香味。3-甲基丁醇檢測閾值較低，具有白蘭地的味道，是國標GB2760-86中規定的可以食用的香料。由表6可知，SLC 1發酵乳中檢測到了乙醇、3-甲基丁醇、三乙二醇和2-乙烯氧基乙醇四種醇類物質，在4株干酪乳桿菌發酵乳中所含醇類物質種類最豐富，而菌株KLC 1發酵乳中僅檢測到了乙醇和戊乙二醇，菌株KLC 2只檢測到了乙醇，菌株XLC 2發酵乳未檢測到醇類物質。烯烴類物質α柏木烯和α-蒎烯可用作香料成分，菌株XLC 2發酵乳僅含有α柏木烯，其余3株干酪乳桿菌發酵乳均檢測到了α柏木烯和α-蒎烯，其中菌株SLC 1發酵乳烯烴類物質相對質量分數最高。

表6 發酵乳中揮發性成分的GC-MS分析結果

綜上所述揮發性香味成分對比分析中，SLC 1發酵乳所含揮發性香味成分（酸類、酮類、醛類、酯類、醇類、烯烴類物質）的種類最為豐富。

2.3.3.3 發酵乳感官評價

感官評價主要從顏色、組織狀態、口感、風味4個方面對發酵乳的品質進行綜合評價，4株干酪乳桿菌發酵乳感官評價結果如表7所示。

表7 發酵乳感官評價結果

4株干酪乳桿菌發酵乳的顏色均呈乳白色且無乳清析出和氣泡產生，因此顏色、組織狀態差異不顯著，均達到國標對發酵乳品質感官評價的要求。口感方面，針對爽口、酸甜兩個指標，SLC1、KLC1具有較好的爽口感，酸甜適宜，口感表現最優，XLC 2、KLC 2則與之差異顯著，口感表現不突出。4株干酪乳桿菌發酵乳口感表現為SLC 1＞KLC1＞XLC 2＞KLC 2，SLC 1口感最好。香氣成分方面，SLC 1發酵乳香氣成分層次最為豐富，與其他3株干酪乳桿菌發酵乳相比，具有顯著性差異，SLC 1發酵乳風味表現最優，與GC-M S測定結果相吻合，表明發酵乳中揮發性香氣成分種類越豐富，發酵乳的風味越好。綜合上述結果，菌株SLC 1發酵乳在顏色、組織狀態、風味、口感等方面總體表現最佳。

2.4 4種發酵乳主成分分析及評價

以發酵乳的香氣成分（乙醛、雙乙酰、酸類、酮類、醛類、酯類、烯烴）和口感（酸度、持水力、氨基氮、硬度、稠度、凝聚性、黏性指數）為指標進行主成分分析。提取前3個主成分的特征值和貢獻率（如表8所示），累計貢獻率可達到100%。前3個主成分代替原有14個指標可充分評價發酵乳的綜合品質[34]，每個主成分占3個主成分總貢獻率的多少（%）作為權數，按照公式

計算主成分綜合得分，F=0.4626F1+0.2889F2+0.2184F3；其中 F1，F2，F3分別為前3個主成分得分值。發酵乳綜合得分如表9所示，4株干酪乳桿菌發酵乳的綜合得分由高到低依次為SLC 1＞KLC 1＞XLC 2＞KLC 2，與感官評價結果一致，說明該綜合評價模型可靠，表明SLC 1綜合指標最優。

表8 提取主成分的特征值及貢獻率

表9 發酵乳綜合評價得分

3 結 論

來源于新疆不同地區的8種開菲爾粒，從中分離鑒定出15株干酪乳桿菌。針對15株菌進行了發酵乳的酸度、活菌數、持水力、乙醛、雙乙酰、氨基氮等指標的分析，初步篩選出4株發酵性能較好的干酪乳桿菌，分別為SLC 1，XLC 2，KLC 1，KLC 2；4株菌各項發酵性能指標均符合國標要求，蛋白質分解能力尤其突出，遠優于現有文獻報道的干酪乳桿菌[28]。而后針對4株干酪乳桿菌進行了發酵乳的硬度、稠度、凝聚性、黏性指數等質構特性測定，發現菌株SLC 1和KLC 1發酵乳的的質構特性指標較為突出；揮發性香氣成分分析、SLC 1香氣成分最為豐富。最后通過主成分分析建立了發酵乳香氣成分與口感指標的綜合評價模型F=0.6128F1+0.2764F2+0.1109F3，4株干酪乳桿菌發酵乳綜合得分從高到低依次為SLC 1＞KLC 1＞XLC 2＞KLC 2,與感官評價結果一致，從而表明15株干酪乳桿菌中菌株SLC 1綜合發酵性能最優，可用于發酵乳制品工業化生產，或作為益生乳制品復合發酵劑的配伍菌種用于工業化生產。