高活菌型牛羊奶混合發酵乳的工藝優化

單靜，常小靜，康曉靜，艾春梅，趙彥珺，萬騰騰，姜竹茂

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.河南三劍客農業股份有限公司，河南漯河462000）

0 引 言

羊奶作為一種比較獨特且又營養豐富的乳品資源，含有200多種營養物質和生物活性物質，被稱為“奶中之王”，但由于其風味缺陷一直難以被消費者接受，嚴重制約了羊奶資源的開發利用[1-3]。牛羊奶混合發酵乳是以牛奶和羊奶為原料，在添加低聚果糖的基礎上由微生物發酵制成的一種高活菌型乳制品，具有更高的鈣含量及更強的保水能力[4]，明顯優于僅有牛奶或羊奶發酵制備的發酵乳。且經過乳酸菌發酵后可以明顯改善羊奶風味，賦予混合發酵乳一種獨特口感，有益于推動羊奶市場的發展。

低聚果糖作為一種對多數益生菌增殖作用較明顯的益生元，可以促進乳品發酵，明顯縮短發酵時間，改善發酵乳的口感及穩定性，并有效抑制腸道內有害菌群的侵染定植，提高機體免疫力[5-10]。本文在添加低聚果糖的基礎上，研究各因素對牛羊奶混合發酵乳感官品質的影響，進而生產出一種含有高活菌數新型發酵乳制品。

1 實驗

1.1 材料與試劑

牛奶，羊奶，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，低聚果糖，MRS固體培養基（自制），蔗糖等。

1.2 儀器與設備

CR J-0.03/60型均質機，FA 1004型電子天平，EM-30型磁力攪拌水浴鍋，DNP-9082型電熱恒溫恒濕培養箱，SW-CJ-ID型超凈工作臺，ZBM 1380HPA型冰箱。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 高活菌型牛羊奶混合發酵乳制備要點

（1）牛羊奶混合比例的確定。牛羊奶分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例混合，添加7%的蔗糖與1.2%的低聚果糖，預熱均質殺菌后，接種2.5%的發酵劑，于42℃恒溫培養箱中發酵7 h，經后熟處理后通過感官評價確定最佳混合比例。

（2）低聚果糖添加量的確定。由于低聚果糖對益生菌具有較好的增殖作用，可以明顯縮短發酵時間，改善發酵乳的風味。因此以牛羊奶混合比例2:1，蔗糖添加量7%，低聚果糖添加量（0，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%），預熱均質殺菌后，接種2.5%的發酵劑，于42℃恒溫培養箱中發酵7 h，經過后熟處理后分析不同低聚果糖添加量對牛羊奶混合發酵乳感官品質的影響以及在4℃條件下貯藏21 d內活菌數的變化趨勢，并確定低聚果糖的最佳添加量。

1.3.3 單因素實驗

在其他因素不變的情況下，依次選取蔗糖添加量（3%，5%，7%，9%，11%）、菌種添加量（1%，1.5%，2%，2.5%，3%)、發酵時間(5 h，6 h，7 h，8 h，9 h)和發酵溫度（38℃，40℃，42℃，44℃，46℃）4個因素的不同水平進行單因素試驗。

1.3.4 評價方法

（1）感官評價：隨機選定10名（男女各半）有經驗的品評員組成的感官評分小組。采用加權評分法[11]對產品的感官品質進行綜合評定，根據產品組織狀態、色澤和風味等3項指標進行感官評價，滿分100分。各項指標所占分值及評定標準如表1所示。

（2）酸度測定：按照GB 5009.239-2016《食品酸度的測定》中酚酞指示劑法。

2 結果與分析

2.1 牛羊奶混合比例對牛羊奶混合發酵乳感官評分的影響

圖1 牛羊奶混合比例對牛羊奶混合發酵乳感官評分的影響

牛羊奶適宜的混合比例才能賦予發酵乳特有的醇厚風味，穩定的組織狀態，以及細膩爽滑的口感。由圖1可知，當牛羊奶混合比在3∶1～2∶1范圍內，感官評分升高，發酵乳的組織狀態越來越穩定，特有的發酵乳風味越發顯著；當牛羊奶混合比為2∶1時，發酵乳的感官評分最高，此時呈現明亮的乳白色，酸味醇厚，爽滑適口；而當牛羊奶混合比在1∶1～1∶3范圍時，發酵乳凝乳狀態較差，羊膻味較強，感官評分下降，因此牛羊奶混合比例固定為2∶1。

2.2 低聚果糖添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

圖2 低聚果糖添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

表1 牛羊混合酸奶感官評價標準

圖3 不同低聚果糖添加量對貯存期牛羊奶混合發酵乳中活菌數的影響

（3）乳酸菌活菌數測定：按照GB 4789.35-2016《食品微生物檢驗》中M RS平板計數法。

由于低聚果糖自身有一定甜度，添加時需要先將

其與白砂糖復配調節到適當的甜度后，再加入發酵乳中發酵[7]。由圖2和圖3可知，隨著低聚糖添加量的增加，發酵乳的感官評分逐漸升高，而酸度的變化趨勢不顯著。當低聚糖添加量為1.2%時，發酵乳感官評分達到最高分。通過對不同低聚糖添加量貯存期內牛羊奶混合發酵乳中活菌數的對比，可以明顯看出發酵乳在4℃，21 d內，活菌數呈下降趨勢，但添加低聚果糖的發酵乳活菌數明顯高于對照組，其中添加1.2%低聚果糖的發酵乳在貯藏期一直保持較高的活菌數水平。當低聚果糖添加量過高時，可能是高濃度的低聚果糖在發酵乳中形成了高滲透壓，對乳酸菌產生一定的脫水作用而抑制了其生長[12]，因此固定低聚果糖的添加量為1.2%。

2.3 單因素試驗結果與分析

2.3.1 蔗糖添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

圖4 蔗糖添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

在發酵乳生產過程中添加蔗糖不僅可增加乳中干物質含量，而且能有效促進凝乳，緩和酸度，提高口感質量。適宜的蔗糖濃度可以促進乳酸發酵，但是蔗糖濃度過高時將會抑制整個發酵過程[13-14]。由圖4可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分也隨之升高，當蔗糖添加量為7%時，發酵乳的感官評分最高，酸甜適口，口感最佳。當蔗糖添加量過多時，會造成發酵乳有甜膩感，感官評分也隨之降低。

2.3.2 菌種添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

圖5 菌種添加量對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

由圖5可知，菌種添加量對牛羊奶混合發酵乳的感官評分以及酸度影響顯著。在牛羊奶混合發酵乳發酵過程中，兩菌1∶1混合能有效提高發酵速率，并且

保加利亞乳桿菌的產物對發酵乳的風味有很大的影響[15]。當菌種添加量為2.5%時，發酵乳的感官評分達到最高，此時具有較好的產黏特性以及適宜的酸度，組織狀態均勻穩定，口感爽滑細膩，風味醇厚。當菌種添加量小于2.5%時，發酵乳的酸度隨菌種添加量的增加而增大，但為了使酸度和黏度達到要求，需要延長發酵時間，費時費力，造成額外損失。當菌種添加過量時，由于發酵初期凝乳較快，導致產酸加快同時凝乳中出現蛋白質脫水收縮現象，致使乳清析出過多，產品組織粗糙，造成發酵乳質量較差。

2.3.3 發酵時間對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

圖6 發酵時間對牛羊奶混合發酵乳綜合評分的影響

由圖6可知，在發酵過程中，由于奶中蛋白凝聚，使蛋白質的三維網絡凝膠形成的程度越來越高，酸度逐漸增大，發酵乳凝固狀態也越來越好[16-17]。當發酵時間達到7 h時，發酵乳的組織狀態均勻細膩，酸甜比最佳，感官評分最高。隨著發酵時間的延長，發酵酸度在達到一定程度后，混合菌繼續產酸，部分酪蛋白溶解，使發酵乳中蛋白凝膠體受到破壞，導致黏度降低[18]。并且當發酵時間過長時，乳酸菌過度繁殖，使發酵乳產酸過快，易造成甜酸比失調，組織狀態不穩定，乳清析出較多。因此，選擇合適的發酵時間可以使發酵乳中的蛋白形成良好的凝膠體，并維持適宜的酸度，獲得較好的感官品質。

2.3.4 發酵溫度對牛羊奶混合發酵乳綜合品質的影響

圖7 發酵溫度對牛羊奶混合發酵乳綜合品質的影響

由圖7可知，隨著發酵溫度的升高，牛羊奶混合發酵乳的感官品質先升高后降低。當發酵溫度在38℃～42℃之間，發酵乳的產酸性和凝固性逐漸增強，并在42℃達到最高分，此時發酵乳的口感最佳，混合菌相互促進生長，凝乳狀態較好。高于42℃后，由于混合菌產酸性增強，發酵乳酸味過重，凝乳性較差，造成大量乳清析出。因此固定牛羊乳混合發酵乳的培養溫度為42℃。

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面優化方差分析

在單因素實驗的基礎上以及分析各因素對牛羊奶混合發酵乳發酵工藝影響的大小，采用Box-Behnken中心組合設計原理，以蔗糖添加量、菌種添加量和發酵時間為考察因素，牛羊奶混合發酵乳的感官評分（Y）為響應值，建立數學模型，以獲得其最佳發酵工藝條件。響應面試驗因素與水平編碼、Box-Behnken設計方案及響應值結果和Box-Behnken實驗方差分析如表2、表3、表4所示。

表2 響應面試驗因素與水平編碼

表3 Box-Behnken設計方案及響應值結果

對表3中進行處理，并進行多元回歸擬合，獲得感官評分(Y)對蔗糖添加量（A）、菌種添加量（B）和發酵時間（C）的二元多項回歸的擬合代碼方程為：Y=92.24+0.59A+0.17B-0.11C-0.18AB+0.15AC-0.98BC-2.24A2-2.17B2-1.49C2。

對回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表4。該方程的相關系數R2=0.9927，整體模型達到極顯著水平（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.1773），說明回歸方程對實際情況具有良好的模擬度。回歸模型的校正系數R2adj=0.9833，說明98.33%的響應值變化可以用此模型進行有效的解釋。各項的P值表明，方程中A、BC、A2、B2、C2對響應值影響顯著（P＜0.05），影響大小順序為：A＞B＞C，即蔗糖添加量對產品的影響最大，其次是菌種添加量，發酵時間對產品的影響力最小。BC的P值小于0.01，說明菌種添加量和發酵時間對產品的影響存在交互作用極顯著。

表4 Box-Behnken實驗方差分析

2.4.2 響應面分析及工藝優化

圖8 各因素交互作用的響應面圖

由圖8可知，蔗糖添加量、菌種添加量和發酵時間之間均存在一定的交互作用，其中菌種添加量和發酵時間交互作用顯著。當菌種添加量為最優值時，發酵時間對感官評分的影響較為顯著。而發酵時間縮短或延長時，增加或減少菌種添加量均無法提高感官評分，主要是因為縮短發酵時間，不利于菌種的增殖，發酵乳無法達到最佳的酸度及風味。而延長發酵時間，致使發酵乳中蛋白凝膠體受到破壞,導致黏度降低，又因乳酸菌過度繁殖,使發酵乳產酸過快，易造成甜酸比失調，組織狀態不穩定，乳清析出較多，導致感官評分下降。

2.4.3 最佳工藝條件的驗證

利用Design Expert V8.0.6軟件進行分析，得到牛羊奶混合發酵乳的最佳工藝參數為：蔗糖添加量為7.26%，菌種添加量為2.52%，發酵時間為6.95 h。為了驗證回歸模型的可靠性，同時考慮實際操作的可行性，對最佳工藝參數適當調整，即:蔗糖添加量為7.3%，菌種添加量為2.5%，發酵時間為7 h。并按此工藝進行3次平行試驗，得到發酵乳的感官評分為92.2分，與預測值92.3較為接近，表明該模型的擬合程度較高，并且在4℃條件下貯藏21 d后，發酵乳最大活菌數為7.7×107cfu/m L。

3 結論

研究確定了牛羊奶混合發酵乳中牛羊奶最佳混合比例為2∶1，低聚果糖添加量為1.2%，發酵溫度為42℃，并通過單因素試驗確定了發酵時間、蔗糖添加量和菌種添加量的水平，經過Design-Expert.V8.0.6進行響應面試驗優化牛羊奶混合發酵乳的最佳工藝配方為：蔗糖添加量為7.3%，菌種添加量為2.5%，發酵時間為7 h。在此條件下制備的酸奶口感醇厚，酸甜適口，風味獨特。在4℃條件下貯藏21 d后，發酵乳最大活菌數為7.7×107cfu/m L，為工業化生產高活菌型發酵乳提供技術支持，也為羊奶資源的開發利用拓寬了發展渠道。