一株植物乳桿菌的粘附能力及免疫調(diào)節(jié)作用研究

王喆，王蕊 ，陳思涵，范穎，滿朝新，姜毓君,b

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

乳酸菌是對人體有著多種益生功能的微生物，同時也是組成先天性免疫系統(tǒng)重要的部分，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的過程中是不可缺少的[1]。乳桿菌作為重要的益生菌來源，主要是在腸黏膜上發(fā)揮其作用，所以其對腸上皮細(xì)胞的粘附能力是其發(fā)揮益生作用重要的一項標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。益生乳桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[4-5]，以及直接對固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，以達(dá)到預(yù)防和治療相關(guān)疾病，調(diào)節(jié)免疫功能的效果[6-7]。本研究選擇了從西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離得到的4株乳桿菌進(jìn)行實驗，對其對腸上皮細(xì)胞的粘附能力研究比較，從中選出一株有較強粘附能力的植物乳桿菌，對其在動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，找到其在機(jī)體免疫功能方面的證據(jù)，為后續(xù)更科學(xué)地把這株植物乳桿菌應(yīng)用于開發(fā)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)乳制品提供相關(guān)依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、細(xì)胞及動物

干酪乳桿菌TD 085，植物乳桿菌TD 109，植物乳桿菌TD 113，嗜酸乳桿菌TD 124，分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品。

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，昆明系小白鼠。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

M RS培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖20.0 g，Tw een-80 1.0 m L，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g；蒸餾水定容至1 000m L，調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃高壓滅菌15 min，4℃保存。

DM EM細(xì)胞培養(yǎng)液：高糖DM EM 900 m L，胎牛血清100 m L，鏈霉素100μg/m L，青霉素100 U/m L，0.22μm無菌濾器過濾，4℃保存。

RPM I1640完全培養(yǎng)液：RPM I1640培養(yǎng)液過濾除菌，使用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺200 mm ol/L，青霉素100 U/m L，鏈霉素100 ug/L，用無菌的1 m ol/L的HC l或1 m ol/L的N aOH調(diào)pH至7.0～7.2，4℃保存。

小鼠白介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF-α）檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

M TT、ConA、無菌Hank's液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），異丙醇，氫氧化鈉，鹽酸，氯化鈉，碳酸氫鈉，臺盼藍(lán)等。

1.1.3 儀器和設(shè)備

BCN 1360型生物潔凈工作臺，HF90型CO2培養(yǎng)箱，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，低溫冷凍離心機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 菌體對細(xì)胞的黏附作用

1.2.1.1 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞在含有10%的胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的高糖DM EM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞單層生長到覆蓋培養(yǎng)瓶表面80%左右時，用PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，以1∶2的比例進(jìn)行傳代后，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，傳4代左右進(jìn)行粘附實驗。

1.2.1.2 乳桿菌的培養(yǎng)

分別將四株乳酸菌于MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)36～48 h后分別挑取單菌落培養(yǎng)于液體M RS培養(yǎng)基，12 h后，按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，傳3代后即為實驗菌株。

1.2.1.3 細(xì)胞與菌體的共培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞以每孔1×106個的濃度接種于6孔板，連續(xù)培養(yǎng)至極化狀態(tài)（18～21 d），此時加入菌體共培養(yǎng)。離心后棄上清，將菌體用無菌PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)速為8 000 r/m in，4℃離心5 min，將菌體重懸于PBS即為實驗所需菌體。將重懸好的菌體以108個/孔的量加入到六孔板中，每株菌做3個平行孔，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h。用保存在4℃的PBS將實驗組（乳桿菌作用）和對照組（無乳桿菌作用）的Caco-2細(xì)胞沖洗3次，將未粘附的菌體洗脫，隨后用胰酶消化收集細(xì)胞，進(jìn)行稀釋涂布平板計數(shù)，計算菌體的黏附率。

1.2.2 免疫指標(biāo)檢測

1.2.2.1 動物分組及給藥方法

本研究采用昆明系小鼠，體質(zhì)量20g±2g，分為對照組（灌服生理鹽水）、實驗組（低劑量、中劑量和高劑量）。將植物乳桿菌TD 109制備成菌數(shù)107，108和109m L-1的菌懸液，按1m L（每100 g體質(zhì)量），以表1設(shè)計方案灌服給各組小鼠，每日1次，灌胃期間自由取食，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2.2 臟器指數(shù)測定

在末次灌胃24 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量，然后將小鼠脫頸處死，摘取脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，按如下公式計算臟器指數(shù)[8]，即

臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量（m g）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.2.3 細(xì)胞因子測定

于末次灌胃后24 h摘眼球采集全血，將采集的全血放入4℃冰箱靜置過夜，3 000 r/m in離心3 min，分離血清于離心管中備用。本實驗采用的檢測方法是雙抗體夾心ABC-ELISA法，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，繪制標(biāo)注曲線，計算血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α質(zhì)量濃度。

1.2.2.4 M TT活力測定

將小鼠斷頸處死后，無菌取脾臟，將脾臟200目篩網(wǎng)研磨后過濾，用除菌后的Hank's液洗2次，離心10 min（1 000 r/m in）。然后取1m L完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮于其中，用臺酚蘭染色，從而計數(shù)活細(xì)胞（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106m L-1。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL的脾細(xì)胞懸液，每個樣本設(shè)10個重復(fù)孔，再加入終質(zhì)量濃度為5μg/m L的ConA溶液 150μL，并用含 10%胎牛血清的RPIM 1640作空白對照。置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入質(zhì)量濃度為5 m g/m L的M TT 50μL，繼續(xù)孵育4 h，棄掉上清液，每孔加入150μL DM SO，輕微振蕩，在酶標(biāo)儀570 nm讀數(shù)，以空白對照孔矯正零點，結(jié)果以570 nm處的OD值表示[8]。

1.2.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0處理，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，不同分組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）的方法，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘附能力測定

細(xì)胞的培養(yǎng)如圖1和圖2所示。

表1 實驗分組及飼養(yǎng)方式

不同菌株黏附能力比較：乳桿菌主要在腸黏膜上發(fā)揮其益生功能，所以乳桿菌對腸上皮細(xì)胞的粘附能力是對其進(jìn)行評價重要的一項標(biāo)準(zhǔn)，粘附能力高的菌株對免疫作用的發(fā)揮也有著促進(jìn)的效果。由圖3可知，不同乳桿菌對Caco-2的粘附能力存在顯著差異，四株菌對細(xì)胞的粘附率分別為14.59%，18.63%，9.66%和3.71%。其中，植物乳桿菌TD 109的粘附率最高，與之前的研究[9-10]相比，具有較高的粘附率，因此選用植物乳桿菌TD 109來進(jìn)行后續(xù)的研究。圖3中，數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2.2 臟器指數(shù)測定

胸腺是免疫相關(guān)的中樞器官，直接影響著外周免疫器官的發(fā)育以及細(xì)胞及體液免疫功能[11]；脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞，其臟器指數(shù)也可以在一定程度上反映出機(jī)體免疫能力的強弱，所以選擇對小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)進(jìn)行測定。由表2可以看出，與對照組相比，植物乳桿菌TD 109灌胃后的各組在胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)上均出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），說明低劑量、中劑量以及高劑量的植物乳桿菌都對小鼠的免疫力起到提高的作用。低、中、高劑量的胸腺指數(shù)之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），低劑量組的脾臟指數(shù)與高劑量組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞因子測定

細(xì)胞因子在動物機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中起著非常重要的作用，對小鼠的研究表明，乳酸菌可以影響小鼠血液中細(xì)胞因子的含量。對患有腫瘤疾病的小鼠進(jìn)行干酪乳桿菌飼喂后，其體內(nèi)的IL-12和IFN-γ水平有所增加[12]，還有實驗證明，乳酸菌可以通過抑制INF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來實現(xiàn)對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[13-14]。本實驗選用了IL-2、IFN-γ、TN F-α三種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以反映機(jī)體的免疫功能。

由表3可知，灌服植物乳桿菌TD 109提高了小鼠體內(nèi)IFN-γ和IL-2的含量，且促進(jìn)作用隨濃度增加而增強，高劑量組與低、中劑量相比有統(tǒng)計學(xué)差異，但低劑量和中劑量之間無統(tǒng)計學(xué)差異。TN F-α的含量在乳桿菌灌胃后得到降低，但各劑量間無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 M TT活力測定

M TT是一種測定細(xì)胞相對活力的方法，可以用來間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。表4顯示，植物乳桿菌TD 109可以增強脾細(xì)胞代謝M TT活力，與對照組比較，菌濃度為107，108和109m L-1的實驗組均顯現(xiàn)了顯著性差異，且增強作用隨多糖濃度的增加而增強，進(jìn)一步反映出該株植物乳桿菌對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

表3 植物乳桿菌TD109對IL-2，IFN-γ，TNF-α的影響ng/m L

3 結(jié)論

本研究對選取的4株乳酸菌進(jìn)行了黏附能力的比較，結(jié)果表明植物乳桿菌TD 109具有較強的黏附能力，可達(dá)到18.63%。在對小鼠臟器指數(shù)的測定結(jié)果中，與對照組相比較，低劑量、中劑量、高劑量組均有統(tǒng)計學(xué)差異，小鼠的免疫臟器發(fā)育得到了明顯的促進(jìn)。以上結(jié)果證明，TD 109可以通過促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟等免疫器官的發(fā)育，起到提高免疫功能的作用[15-16]。在細(xì)胞因子方面，小鼠血清中的IL-2和IFN-γ質(zhì)量濃度，經(jīng)過乳桿菌灌胃處理后都得到了顯著的提高，腫瘤壞死因子TNF-α也出現(xiàn)了顯著的降低，同時，通過MTT含量的測定，進(jìn)一步地證明了此株菌的免疫功能。

表2 植物乳桿菌TD109對小鼠臟器指數(shù)的影響 mg/g

圖2 達(dá)到極化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞（200×）

圖3 不同乳桿菌對Caco-2細(xì)胞的粘附率

表4 植物乳桿菌TD109對MTT活力的影響

圖1 Caco-2細(xì)胞的生長狀態(tài)

綜上所述，植物乳桿菌TD 109具有一定的免疫增強作用，為對植物乳桿菌TD 109免疫相關(guān)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。