兔非人工通氣主動脈瓣上縮窄-松解模型的建立及評價

趙 哲，陳 林，帥維正

左心室肥大是心臟對高血壓、瓣膜狹窄以及主動脈縮窄等長期壓力超負荷狀況的適應性反應[1]。然而，長期嚴重的壓力超負荷，會使生理性心肌肥厚發展成病理性改變[2]。主動脈瓣狹窄的患者在主動脈瓣置換術后，左心室肥大會出現逆轉，但是Heinzel等[3]發現，該逆轉是不完全的，表現在心肌纖維化，左室重構和功能障礙。目前，左室肥厚逆轉的分子機制尚不清楚。為更好地研究左心室肥大的疾病機制及治療方法，有必要建立一個理想的動物模型。在大多數關于左心室肥大的研究中，實驗動物需行開胸手術，手術時，氣管插管和機械通氣往往是必需的。然而，有研究指出，氣管插管可能會使實驗動物出現嚴重的氣管損傷及嚴重的后遺癥[4]。本研究建立的兔模型可用于研究左心室肥大及其逆轉，且不需氣管插管，不使用機械通氣。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康新西蘭大白兔43只，雌雄不拘，3～4月齡，體重(1.93±0.11)kg，由第三軍醫大學附屬新橋醫院實驗動物中心提供，實驗動物合格證書編號(渝)20017-0010。經過一段適應期后，實驗動物被隨機分組，37只開胸行升主動脈縮窄術(aortic banding，AB)作為模型組，6只作為假手術組(sham)。模型組中，有2只實驗兔在行主動脈縮窄手術時死于氣胸。其余完成手術的實驗兔隨機分為：升主動脈縮窄8周組(AB8w，n=6)，升主動脈縮窄16周組(AB16w，n=6)，升主動脈縮窄24周組(AB24w，n=5)，早期去縮窄(debanding，DB)組(AB8w+DB8w，n=8)，晚期去縮窄組(AB16w+DB8w，n=8)。AB8w組、AB16w組及AB24w組在相應時間點行血流動力學檢查，檢查結束后處死取心臟標本，行組織學檢查。動物飼養與實驗均遵照《第三軍醫大學實驗動物飼養與使用規定》。

1.1.2 主要試劑、儀器及材料 戊巴比妥鈉(西南藥業有限公司)，硫化鈉(重慶化學試劑廠)，青霉素G鈉注射粉針(華北制藥股份有限公司)，電子天平(德國Sartorius公司BS124S型及BS4202S型)，多功能生理記錄儀(澳大利亞Powerlab公司ML870型)，超聲診斷儀(挪威GE威曼超聲Vivid7型，探頭頻率8MHz)，顯微圖像采集系統(德國Leica DMIRB熒光倒置顯微鏡)，透射電子顯微鏡(芬蘭飛利浦TECNAI10型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉方法 將實驗兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，不需氣管插管和呼吸機，保持兔自然呼吸狀態，仰臥位固定，無需給氧。手術過程中，每5 min檢查1次足蹬反射。

1.2.2 手術方法 參照Zhao等[5]的方法完成兔升主動脈縮窄手術。隨機分配到去縮窄組的實驗兔在升主動脈縮窄術后8周及16周分別行升主動脈縮窄解除術。麻醉及術前準備同前。沿胸部原切口切皮，逐層切開皮膚，皮下筋膜，可見縫合胸部肌肉的陳舊性縫線。切開胸部肌肉至胸骨。游離胸骨下端，為預防氣胸的發生，嚴格沿原胸骨切口剪開，直至完全分開。用兒童開胸器小心撐開胸骨，分離胸腺及粘連組織。顯露升主動脈根部，找到原先結扎的Prolene線。小心分離結扎線，顯露線結根部。拎著線頭，用剪刀剪斷線結的一側，然后緩慢拉出完整的結扎線。胸腔內噴灑青霉素溶液400 000 U后，逐層關胸。術后正常飲食，連續3 d給予青霉素預防感染(200 000 U，肌肉注射，2/d)。

在整個實驗過程中，實驗兔均單籠飼養，可自由進食飲水。動物飼養室可以控制溫度、濕度，并采用12 h光照、12 h黑暗的光線控制。

1.2.3 超聲心動圖檢查 分別于術前和升主動脈縮窄術后2、4、8、10、12、16、18、20、24周，以及升主動脈縮窄解除術后2、4、8周行超聲心動圖檢查。按照美國超聲心動圖協會建議的方案[6]，通過M型超聲測量以下參數：心率，左室舒張末內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)，左室收縮末內徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESd)，舒張期室間隔(end-diastolic intraventricular septal thickness,IVS)及左室后壁(left ventricular wall thickness at diastole,LVPW)的厚度，左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)。并計算左室舒張末外徑(external left ventricular diastolic diameter,ExLVDd)=左室舒張末內徑+舒張期左室壁厚度+舒張期室間隔厚度，左室質量指數(left ventricular mass index,LVMI){即[(ExLVDd3-LVEDd3)×1.055]/體重}，h/r(舒張期室壁厚度/左室腔的半徑)比率[7]。通過多普勒超聲評估升主動脈的縮窄程度及縮窄處的壓力階差。

1.2.4 血流動力學檢查 實驗兔麻醉后，仰臥位固定于檢查臺，手術分離出右頸總動脈。將與壓力換能器連接并充滿肝素鹽水的醫用導管插入頸動脈，壓力換能器通過載波放大器與多導生理記錄儀相連，所記錄的壓力代表循環血壓。松開血管夾，將導管逐漸向心臟插入，一邊插入一邊觀察電腦顯示屏上的壓力波形。進入左心室后，開始記錄波形，緩慢后撤導管，導管接近頸動脈切口時，停止記錄。利用生理記錄儀自帶軟件Chart 5.2.1中文版，計算以下指標：左室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)，左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)，等容收縮期左心室壓力上升的最大速率(+dp/dt max)，等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt max)，心率(heart rate,HR)。

1.2.5 組織學檢查 將兔麻醉后，用電子天平(德國Sartorius公司BS4202S型)稱量兔子的體重。經耳緣靜脈注射肝素300 U，在胸骨左側1 cm處開胸，完整取出心臟后用4 ℃磷酸鹽緩沖液(pH=7.40)沖洗干凈，濾紙吸干。去除右室、右房及左房，將左室置于電子天平(德國Sartorius公司BS124S型)上稱重[8]。然后將左室置于10%甲醛溶液中固定48 h，平行房室溝將心室肌切成2 mm的薄片。石蠟包埋后，切取5 μm厚的心肌切片行HE染色。

1.2.6 透射電鏡檢查 擬行電鏡檢查的兔心臟標本，從室間隔下部取1 mm×1 mm×2 mm的長條狀心肌組織數塊。用2.5%戊二醛及1%鋨酸固定12 h，脫水后，用環氧樹脂浸潤、固定、聚合24 h。取1 μm的組織切片置于載玻片上，用1%的甲苯胺藍染色。用金剛刀切取70 nm的超薄切片，并用200目的銅載網收集，用透射電子顯微鏡采集圖像。

2 結果

2.1 一般情況 在主動脈縮窄組中，有2只實驗兔在行主動脈縮窄手術時死于氣胸。有2只實驗兔分別于升主動脈縮窄術后21 d及90 d死于急性心力衰竭。行主動脈縮窄解除術時，AB8w+DB8w組有1只兔子死于氣胸，AB16w+DB8w組有2只兔子死于氣胸。為了維持實驗數據的完整性，死亡動物的超聲心動圖檢查數據不用來分析。sham組實驗兔沒有死亡發生。升主動脈縮窄手術的死亡率是5.4%(2/37)，升主動脈縮窄解除術的死亡率是18.8%(3/16)。該動物實驗的總死亡率是16.3%(7/43)。

2.2 超聲心動圖指標 升主動脈縮窄組：與術前相比，LVPW在升主動脈縮窄4周內明顯增厚，之后逐漸變薄。LVMI在升主動脈縮窄后8周時增加了129.2%，8～24周沒有進一步增加。FS在縮窄的前2周明顯增大(P<0.01)，之后則逐漸減小。LVESd在升主動脈縮窄術后的前2周，略有減小，之后則顯著增大(P<0.01)。LVEDd的變化與LVESd相似。h/r在前2周明顯增大，之后則逐漸減小，說明實驗兔心臟發生了由向心性肥厚到離心性肥大的轉變，最明顯的轉折點是升主動脈縮窄術后8周。

縮窄解除組：在升主動脈解除術后的8周觀察期內，LVMI明顯減小，LVPW明顯變薄，心室內徑明顯變小，這些指標都逐漸接近假手術組水平。同時，FS逐漸增加，提示心功能逐漸好轉。早期去縮窄組與晚期去縮窄組也有一定差異，早期去縮窄組在術后2周的變化較晚期去縮窄組明顯，而且去縮窄術后8周恢復的程度也比晚期去縮窄組更明顯(P<0.01)。說明在本研究中，心臟結構、功能的恢復程度與縮窄持續的時間有關。h/r中有個有趣的現象：早期去縮窄組，在去縮窄術后4周內，其明顯低于主動脈縮窄術組，去縮窄術后8周時明顯高于主動脈縮窄術組，接近正常水平。這種現象出現的原因在于：升主動脈縮窄解除術后，室壁厚度明顯減小，而室腔大小恢復較慢，從而造成它們的比值在術后初期明顯減小。這種現象說明在去縮窄術后恢復進程中，室壁厚度的恢復要早于室腔大小的恢復。

假手術組的上述超聲指標在24周的觀察期內比較無統計學意義(P>0.05)，各組實驗兔的心率比較無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 血流動力學檢測 3個升主動脈縮窄組與sham組相比，LVSP差異有統計學意義(P<0.01)，AB8w+DB8w組、AB16w+DB8w組與sham組相比差異無統計學意義(P>0.05)。AB8w+DB8w組與AB16w組相比、AB16w+DB8w組與AB24w組相比，LVSP差異有統計學意義(P<0.01)。+dp/dt max的變化趨勢與LVSP相似，3個升主動脈縮窄組與sham組相比差異均有統計學意義(P<0.01)。-dp/dt max的變化稍有不同，AB8w組與sham組相比(P>0.05)，說明舒張功能的降低仍然不是非常明顯。AB16w組、AB24w組與sham組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。AB8w+DB8w組與AB16w組相比、AB16w+DB8w組與AB24w組相比，+dp/dt max和-dp/dt max差異有統計學意義(P<0.01)。說明升主動脈縮窄解除術后，心臟的收縮功能和舒張功能都有明顯好轉。

AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組比較，-dp/dt max差異有統計學意義(P<0.01)，而+dp/dt max差異無統計學意義(P>0.05)，說明縮窄時間的長短對縮窄解除術后心臟舒張功能的恢復有重要影響。見表1。

注：與sham組比較，aP<0.01；AB24w組與術前比較，bP<0.01；與AB24w組比較，cP<0.01；AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組在觀察期結束時比較，dP<0.01■：AB24w組，●：sham組，△：AB8w+DB8w組，◇：AB16w+DB8w組圖1 各組兔超聲心動圖檢查結果

表1 各組兔血流動力學檢查結果

注：與sham組比較，aP<0.01；AB8w+DB8w組與AB16w組比較，bP<0.01；AB16w+DB8w組與AB24w組比較，cP<0.01；與sham組比較，dP<0.05；AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組比較，eP<0.01

2.4 左心室質量與體重的比值 實驗數據表明，升主動脈縮窄術后，實驗兔的左心室質量(left ventricular weight,LVW)逐漸增大，體重(body weight,BW)有所減小，故3個縮窄組的LVW及LVW/BW均較sham組明顯增大(P<0.01)。AB8w+DB8w組與AB16w組、AB16w+DB8w組與AB24w組相比，LVW及LVW/BW差異均有統計學意義(P<0.01)，說明升主動脈縮窄解除后，左心室質量明顯減小。AB8w+DB8w組、AB16w+DB8w組與sham組相比，LVW/BW差異有統計學意義(P<0.01)，表明升主動脈縮窄解除8周，不足以使增大的LVW/BW恢復到正常水平。AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組相比，LVW差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.5 組織學檢查 光學顯微鏡檢查：假手術組心肌纖維排列正常，間質無明顯增生，無血管擴張及血管壁增厚等表現。升主動脈縮窄組心肌纖維走行紊亂，心肌細胞肥大，分支增多，間質膠原纖維顯著增生。升主動脈松解術后，實驗兔的心肌細胞肥大明顯減輕，增生的間質膠原纖維明顯減少，AB8w+DB8w組的恢復程度較AB16w+DB8w組更明顯。見圖2。

表2 各組兔左心室質量與體重的比值(LVW/BW)

注：與sham組比較，aP<0.01；AB8w+DB8w組與AB16w組比較，bP<0.01；AB8w組、AB16w組、AB16w+DB8w組與AB24w組比較，cP<0.01；AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組比較，dP<0.05

圖2 各組兔術后不同時間點心肌形態學觀察(HE×400)

透射電鏡觀察，與假手術組比較，升主動脈縮窄組兔的透射電鏡表現有如下特征：①肌原纖維排列紊亂，肌節結構模糊；②閏盤結構不連續、模糊；③核膜凹凸明顯；④線粒體數量明顯增多，部分線粒體腫脹、破裂；⑤灶性的心肌纖維的溶解；⑥肌漿網腫脹、破裂。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察各組兔心肌形態學改變

3 討論

心肌肥大是影響心血管疾病預后的獨立危險因子[9]。心肌肥大在早期是有益的，但是持久的心肌肥大會引起心臟收縮和舒張功能障礙，最終導致心力衰竭[10]。左心室肥厚的轉歸情況是患者預后的重要觀察指標[11]。迄今為止，主動脈瓣置換術后左心室肥厚的轉歸的分子機制尚不清楚[12]。

本研究成功建立了一種去壓力負荷的動物模型，該模型制作方法簡單、有效、重復性好。使用兔子首次在不用氣管插管和機械通氣的情況下，完成了壓力超負荷引起左心室肥厚并繼續研究左心室肥厚的轉歸。該模型有2個突出的優點：①引起左心室肥厚的誘因為相對單純的升主動脈縮窄，受藥物及神經體液等因素的干擾相對較少[13]；②實驗動物不需要行氣管插管和人工通氣，從而避免了氣管插管可能引起的嚴重的氣管損傷和后遺癥，以及人工通氣相關的并發癥[4]。

我們之所以選擇兔子作為實驗動物，是因為兔子的胸腔解剖較其他動物具有獨特的優勢，其胸腔被縱隔分為左右兩部，互不相通，肺被肋胸膜和肺胸膜隔開，心臟又被心包胸膜隔開[14]。因此，開胸時，只要不弄破縱隔膜，動物不需要人工通氣，從而省掉了氣管插管的麻煩。而豬、狗、鼠等動物開胸后一定要作人工呼吸，才能進行手術。

結扎線的選擇也是非常重要的。普通絲線在結扎時組織損傷大，可能造成動脈破裂，而且會造成比較強的組織反應，從而導致升主動脈縮窄解除手術時去除結扎線非常困難。可吸收縫線因為有可能出現縫線被吸收、縮窄自動消除的隱患，所以不在考慮范圍[15]。我們選用Prolene線作為結扎線，因為它在結扎時對組織的損傷小，組織反應輕，粘連輕，利于升主動脈縮窄解除手術時去除結扎線。在本研究中，未出現主動脈破裂的現象，縮窄解除時去除結扎線也很容易。

超聲心動圖可以無創監測兔心臟結構和功能的變化，并可以重復估算左心室質量[16]。在本研究中，在壓力超負荷的前2周，可以觀察到左心室質量和室壁厚度的快速增加，而左心室內徑卻減小了或保持不變。所以，壓力超負荷導致的左心室肥大在早期階段是向心性肥大，室壁增厚是左心室質量增加的主要因素。在該階段，FS仍在正常范圍，表明心臟完全代償了增加的后負荷。升主動脈縮窄后4～8周，左心室質量和室壁厚度沒有進一步增加，但是左心室腔逐漸擴大，FS降低了，意味著發生了離心性心室肥大和心臟失代償狀態。h/r比率可以很好地反映左心室內徑的變化。在壓力超負荷的前4周，h/r比率較假手術組增加。8周后，縮窄組的h/r比率開始低于假手術組并持續下降。FS的變化曲線與h/r比率相似，表明左心室內徑與心臟功能之間有相關性。總之，這些變化反映了在該模型中實驗兔心臟從向心性左心室肥大向離心性左心室肥大的轉變。

升主動脈縮窄解除術后，心臟的各項超聲心動圖指標都有所改善，具體表現在：室壁厚度減小，心室內徑減小，心室質量減小，FS增加。早期去縮窄組與晚期去縮窄組的恢復程度有一定差異，早期去縮窄組在松解術后2周的變化較晚期去縮窄組明顯，而且松解術后8周恢復的程度也比晚期去縮窄組更明顯。說明在本研究中，心臟結構、功能的恢復程度與縮窄持續的時間有關。h/r比率中有個有趣的現象：早期去縮窄組，在去松解術后4周內，其大小明顯低于升主動脈縮窄組，術后8周又明顯高于升主動脈縮窄組，接近正常水平。這種現象出現的原因在于：室壁厚度在去松解術后迅速明顯減小，而室腔大小恢復較慢，從而造成h/r比率在術后初期明顯減小。這種現象提示在去松解術后心室結構恢復的過程中，室壁厚度的恢復要早于室腔大小的恢復。

血流動力學檢查中有類似的表現。升主動脈縮窄解除術后，血流動力學檢查的多數指標逐漸恢復正常。其中，早期去縮窄組與假手術組相比沒有顯著差異，而晚期去縮窄組與假手術組相比則有明顯差異。AB8w+DB8w組與AB16w組相比、AB16w+DB8w組與AB24w相比，+dp/dt max和-dp/dt max差異有統計學意義(P<0.01)，提示升主動脈縮窄解除術后，心臟的收縮功能和舒張功能都有明顯好轉。AB8w+DB8w組與AB16w+DB8w組比較，-dp/dt max差異有統計學意義(P<0.01)，提示縮窄時間的長短對縮窄解除術后心臟舒張功能的恢復有重要影響，早期解除壓力負荷可以更好地改善心臟的舒張功能。

在升主動脈縮窄術后8、16、24周，LVW/BW均明顯增加，較sham組相比差異有統計學意義。升主動脈縮窄組的不同時間點之間相比差異無統計學意義。說明在升主動脈縮窄術后8周時，心臟重量增加即達到高峰，這與超聲檢查的結果是一致的。在升主動脈縮窄解除后，左心室質量明顯減小。AB8w+DB8w組、AB16w+DB8w組與sham組相比，LVW/BW差異有統計學意義(P<0.01)。肥厚心肌的恢復與肥大心肌細胞的尺寸減小有關。LVW與LVWI之間有很好的相關性(r=0.894)，說明由超聲估算的左心室質量指數是可信的。

我們的研究發現，常規病理檢查，升主動脈縮窄組實驗兔可見心肌細胞明顯肥大，肌細胞排列紊亂，間質膠原纖維明顯增生。升主動脈松解術后實驗兔的心肌細胞肥大明顯減輕，增生的間質膠原纖維明顯減少，早期去縮窄組的恢復程度較晚期去縮窄組更明顯。升主動脈縮窄組的透射電子顯微鏡檢查，亦表現出明顯的特征。

我們成功建立了左心室肥厚的動物模型，該模型由壓力超負荷引起左心室肥厚，并在壓力負荷解除后，可以觀察到左心室肥厚的逆轉。該方法可避免氣管插管及機械通氣的損傷和并發癥，效果明顯、重復性好、建模時間短。本研究發現，實驗兔在升主動脈縮窄后，左心室肥厚的發展與收縮功能障礙是一個時間相關的過程。該模型是研究壓力負荷時心肌肥大的發生，發展和轉歸情況的較為理想的動物模型，肥厚心肌的逆轉是目前左心室肥厚臨床治療的終極目標。

本研究也有一定的局限性。眾所周知，小動物與人的左心室肥厚機制多少會有一定的差異。另外，本研究的左心室超負荷是突然發生的、急性的，而高血壓或主動脈瓣狹窄患者的壓力超負荷是逐漸產生的，并且會持續數年。盡管兔與人之間有明顯不同，但是這是一個重要的起步，在此模型的基礎上，可以進一步去探尋與心臟重塑有關的基因特征及改善心血管疾病的治療方法。