凍存溫度、凍融次數和凍存時間對血清生化指標穩定性的影響

范澤涵，章月蟾，索 晨，徐珂琳，薛江莉，李淑元，袁子宇，王久存，金 力，陳興棟

隨著精準醫學研究的發展，大型生物樣本庫不斷興起，它的主要目的是進行生物大分子、細胞、組織和器官等樣本的標準化貯存[1]。在生物樣本采集過程中，由于現場條件限制，如樣本采集無法及時送至實驗室、檢測人員不足等因素，無法立即展開檢測工作的情況時有發生，樣本凍存于生物樣本庫中，等待進一步分析或重復利用。血液樣本是重要的生物樣本類型，由于其易采集、成本低，在基線調查中被廣泛應用，其血清學指標可作為重要的生物標志物，是研究人群健康水平或疾病進程的重要依據。在生物樣本庫中，血清常規貯存溫度為-20 ℃或-80 ℃。相關研究顯示，某些血清生化指標在-80 ℃可以保持幾日到幾個月的穩定，但也有報道指出，隨著貯存時間的延長，其檢測值將出現顯著性改變[2-3]。故對于凍存血清能否在生物樣本庫中保證其樣本質量，目前仍缺乏一致結論。在我國，大型生物樣本庫起步時間較西方國家晚，急需開展相關研究，對目前生物樣本庫常規貯存條件的合理性進行探討[4-5]。本研究探索了凍存溫度及反復凍融效應在9個月內對12種血清生化指標穩定性的影響，旨在確定常規血清生化指標在生物樣本庫中的穩定性。這對于保證后續研究的準確性具有重要意義，也可為今后凍存生物樣本的使用提供指導意見。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年7月1日—8月1日江蘇省泰興市人民醫院的健康體檢者，排除癌癥和糖尿病、高血脂、高尿酸血癥等內分泌疾病者，以及現階段服用藥物者，最終有160例入選。樣本采集經由復旦大學生命科學學院倫理委員會批準通過，所有入選者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集及分組 每名研究對象抽取空腹靜脈血4 mL，離心制備血清(1 600 rpm，15 min)。將研究對象的血清以每4人為一組進行混合，用2 mL EP管進行收集，獲得混合血清40管。將其隨機分為5組(A～E組)，每管繼續分裝為6個亞組(t0、t1、t3、t5、t7、t9亞組)，共獲得240例血清小樣(每例300 μL)。具體分組流程見圖1。

圖1 血清樣本分組流程

1.2.2 樣本處理 血樣采集24 h內檢測t0亞組混合血清的12項生化指標，作為基準值。將剩余小樣放入生物樣本庫中進行9個月的貯存。其中，A組貯存于-20 ℃，B～E組貯存于-80 ℃，C組、D組、E組分別在貯存開始的1、5、10 d內，每天進行一次凍融處理。凍融操作采用過度凍、低溫融的方法，即先冷凍：將樣本在室溫放置0.5 h，再放入冰水混合物中0.5 h，最后放入-20 ℃完全冷凍；后解凍：在冰水混合物中復融0.5 h，再室溫放置0.5 h，最后在震蕩器上充分混勻以保證完全解凍[6]。凍融循環結束后入庫進行凍存，分別在第1，3，5，7，9個月時依次對t1～t9亞組進行檢測。使用全自動生化分析儀(日本TOSHIBA TBA-40 FR)進行檢測，目標分析物包括血清谷丙轉氨酶(alanine amino transferase,ALT)，尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(creatinine,CREA)、胱抑素-C(Cystatin-C,CYS-C)、直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL-C)、總膽紅素(total bilirubin,TB)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和尿酸(uric acid,UA)共12項血常規指標。

2 結果

2.1 目標分析物的穩定性 在生物樣本庫9個月的凍存過程中，監測了12項常規血清生化指標的含量。結果顯示，在5種條件下，12項指標檢測值均不穩定(見表1)。在第9個月時(見圖2)，-20 ℃條件下，除BUN、UA、TC、HDL-C外，其他指標含量均出現下降，其中以ALT下降趨勢最為明顯，可達到53.17%(P<0.001)；BUN、TC、HDL-C在第9個月時的檢測值較基準值高，但整個貯存過程中，其檢測值呈現波動，在第1或第3個月時曾出現顯著性下降；UA呈現上升趨勢，9個月后較基準值上升11.32%(P<0.001)。在-80 ℃貯存組，除TBIL、UA、TC外，其他指標的含量下降，但TBIL、UA、TC在第1個月或第7個月時曾出現含量的顯著性下降。當在-80 ℃條件下施加凍融循環處理時，不穩定性增強，尤其是在施加5次凍融循環時，ALT、TBIL、DBIL、CREA、CYS-C、HDL-C、LDL-C的含量出現了大幅度的下降，其中TBIL、DBIL下降幅度最為明顯，達到28.34%和40.31%(P<0.001)，TG、TC、BUN在10次凍融循環組有顯著性的下降，下降幅度分別為7.14%、5.22%、2.25%(P分別為<0.001、0.02和0.04)。

圖2 第9個月時各指標檢測值(t9)與基準值(t0)的比較

表1 各項指標在不同時間點的檢測值

續表1

2.2 目標分析物穩定性影響因素分析 肝功能指標、糖類和脂類指標檢測值的變化受到凍存溫度及凍存時間交互作用的影響，腎功能指標則是受到時間效應的影響。當溫度保持在-80 ℃，反復凍融效應可影響生化指標的穩定性：反復凍融的單一效應造成腎功能指標、肝功能指標中的ALT、DBIL不穩定；反復凍融及凍存時間的交互效應導致TBIL的不穩定。糖類和脂類指標中，只有TG的穩定性受到反復凍融和凍存時間交互作用的影響，其他指標的波動則是由于受到凍存時間這一單一因素的影響，見表2、表3。

表2 凍存溫度、凍存時間及其交互作用對目標分析物穩定性的影響

注：采取LMM法對A、B組進行比較，分析溫度、時間及二者交互作用對各指標檢測值的影響。固定效應為溫度、時間、溫度與時間的交互作用；隨機效應為不同組分的混合血清(id)和截距項(r)；方差組份估計方法為約束最大似然法(restricted maximum likelihood,REML)；協方差類型選擇無結構類型(unstructured covariance matrix,UN)

表3 反復凍融、貯存時間及其交互作用對目標分析物穩定性的影響

注：采取LMM法對B、C、D、E組進行比較，分析反復凍融次數、時間及二者交互作用對各指標穩定性的影響。固定效應為反復凍融次數、時間、反復凍融次數與時間的交互作用；隨機效應為不同組分的混合血清(id)和截距項(r)；方差組份估計方法為REML；協方差類型選擇UN

3 討論

高質量的生物樣本是生命科學研究的基礎，如何對生物樣本進行合理保存和利用，是近些年來研究者關注的重點[9-10]。本研究分析了不同貯存溫度、貯存時間及凍融循環次數對血清常規生化指標的影響，對凍存血清樣本生化指標在生物樣本庫中的穩定性進行了探索。結果顯示，9個月內12項生化指標在各種貯存條件下均不穩定。導致檢測結果波動的因素有凍存溫度、反復凍融次數、凍存時間，以及凍存溫度、凍融次數與凍存時間分別產生的交互效應。因此，血清樣本并不適合凍存于生物樣本庫中，現有的生物樣本庫凍存環境(-20 ℃或-80 ℃，伴隨凍存過程中難以避免的反復凍融現象)均不利于常規生化指標的穩定性。

曾有研究對生物樣本庫中不同貯存條件下生物樣本的穩定性進行探索，但由于實驗設計及檢測指標的差異，得出的結論缺乏一致性，同時，還需考慮不同國家的生物樣本來源人群存在種族差異。Gislefoss等[11]曾報道，-25 ℃條件下，凍存29年的血清樣本的脂質指標與基準值具有顯著性差異，HDL-C下降69.2%，LDL-C上升31.3%。另一項研究證明，在-20 ℃及4 ℃，酶、酮體和電解質含量在短期內發生顯著性改變，但是在-80 ℃或低于-130 ℃時，其含量可在90 d內保持穩定[12]。法國地區的研究曾對血清指標在室溫下的穩定性進行監測，發現24 h內，各項指標可保持穩定，但超過24 h，FBG及其他指標(C反應蛋白、胰島素、甲狀旁腺激素等)將受到溫度、時間和EP管材質的影響，出現含量的波動。凍融循環也可能破壞生物樣本庫中血清樣本穩定性。在貯存過程中，血清生化指標復檢或樣本分批測量的情況時有發生，導致血清樣本常面臨反復凍融的問題，但是目前凍融循環效應對生化指標的影響仍無具體定論。有研究指出，凍融循環過程中的機械剪切力對生化指標的分子結構極易產生破壞作用，尤其是ALT等酶類物質[13]。但也有研究認為，反復凍融對于TG及TC等脂質指標的影響并不顯著：血清TG與TC可耐受10次以上凍融循環，檢測值與初始值相比未產生顯著性差異[14]。這一良好的穩定性可通過其化學結構來解釋：脂質成分的表面覆蓋一層極性磷脂及游離脂肪酸，其親水基團暴露在外，故脂質在血清水相中較為穩定。然而，本研究對生物樣本庫中凍存的血清樣本生化指標進行了長達9個月的監測，發現指標檢測值圍繞基準值波動，并且在不同時間點出現顯著偏離基準值的情況，說明這種化學性質的穩定并不能在-20 ℃或-80 ℃條件下持續維持，長時間凍存仍會嚴重影響使生化指標的穩定性，從而降低檢測結果的準確性。因此，建議在采樣后24 h內立即送檢，各項生化指標的檢測應以新鮮血清樣本為準。

本研究有如下優點：首先，選取了12項常規的生化指標作為目標檢測物，解決了血清樣本是否適合在生物樣本庫中凍存后再進行檢測的問題，為后續生物樣本的使用提供重要指導意見。同時，制定了嚴格的質量控制系統，為了更好的重現分析研究過程，從血液采集、運輸、分離、分析的過程都嚴格按照生物樣本采集流程進行，整個過程由接受過培訓合格的工作人員進行收集及處理；樣本貯存過程中，配備專人進行設備維護以防止外部環境的污染；采用24 h冷鏈溫控監測系統和報警系統，避免溫度波動對樣本質量的影響；嚴格控制樣本檢測時間，要求樣本出庫后立即檢測；同臺儀器檢測且使用前必須校正。這些措施有效規避了生物樣本庫管理、標本處理不規范的問題，保證了實驗結果的準確性。在數據分析階段，采用了LMM法對血清指標穩定性的影響因素進行了探索。重復測量數據存在著較強的自相關性，常規統計學方法(如線性回歸模型)要求測量數據間的獨立，因此并不適用[13]。LMM法可對重復測量資料的固定效應、隨機效應及協方差矩陣進行參數估計和統計檢驗，被認為是處理該類型資料的重要統計學方法[14]，它對于數據資料的協方差結構要求寬松，可以不滿足球形檢驗，且結論可靠[15]。

存在的不足之處：本研究中，凍存時間梯度設置為1～9個月，若血清樣本在生物樣本庫中進行1個月的短期凍存，其檢測值的穩定性仍未可知。另外，隨著-150 ℃冰箱的不斷普及，各項指標在深低溫環境下是否可以保證長期凍存的穩定性，需要得到進一步探索。

綜上，常規血清生化指標檢測值在生物樣本庫中含量不穩定，導致檢測含量波動的因素有凍存溫度、反復凍融次數、凍存時間，凍存溫度、凍融次數與凍存時間分別產生的交互效應。故血清樣本不宜在生物樣本庫中凍存，應選擇新鮮樣本進行血清常規生化指標的檢測，否則會降低檢測結果的準確性。