精準醫學時代下胸部腫瘤生物樣本庫規范化建設

邢 杰，余科科，張 葉，韓寶惠，徐 蕾

隨著現代科學技術的不斷發展，人們通過大量的基礎醫學研究對當前疾病的認識也越來越深入，然而研究結果越來越多，真正能夠轉化到臨床應用的卻并沒有明顯增多，其中一個重要的原因就是基礎研究和臨床研究之間沒有建立起一個很好的橋梁[1-3]。2011年，國家醫學科技發展十二五規劃明確將生物樣本資源庫作為“支撐醫學項目”重要工作之一，2015年，國家標準化委員會批準成立生物樣本庫標準化委員會，在國家大力支持下，國內的生物樣本庫取得了長足的發展[4-5]。

2016年，國家癌癥中心發布中國最新癌癥數據，其中肺癌的發病率和死亡率均居第一位，因此，與肺癌相關的精準診斷、個體化治療的研究就顯得尤為重要。作為基礎和臨床研究基石的高質量生物樣本則成為重中之重。2016年，上海交通大學附屬胸科醫院胸部腫瘤手術量已逾10 000臺，依托于豐富的臨床資源，我院建立了胸部腫瘤生物樣本庫，建設目標是立足資源平臺建設，推動以肺癌為主的胸部腫瘤發病機制的研究，進而促進多學科診治。

1 精準醫學時代生物樣本庫發展

1.1 國外生物樣本庫建設 國外生物樣本庫起步較早，并且已經形成了信息化和網絡化管理，隨著現代醫學技術的不斷發展，國外對人類生物樣本資源的保存和研究越來越重視，已經實現了生物樣本庫的大型化、產業化和信息化，并且建立了較為完善的法規和技術指南。全球有代表性的生物樣本庫及其國際組織有泛歐洲生物樣本庫與生物分子資源研究平臺、英國生物樣本庫、卡羅林斯卡醫學院樣本庫、盧森堡聯合生物庫、加拿大組織庫協作網絡、國際生物和環境樣本庫協會[6-7]。

1.2 國內生物樣本庫建設 國內生物樣本庫近年來快速發展，與國外相比，雖起步較晚，但依托于強大的人口基數，我們迎頭趕上并且發展勢頭強勁。國內的病種數量以及罕見病種生物樣本的數量是國外無法比擬的。早在1994年，中國科學院就建立了中華民族永生細胞庫，此后山東省臍帶血造血干細胞庫、北京臍帶血造血干細胞庫、復旦大學泰州健康科學研究院、SBC芯超生物銀行、深圳國家基因庫等專項生物樣本資源庫也相繼建立，以上都是較為成功的生物樣本庫[8-9]。

腫瘤專科生物樣本庫的建設隨著生物樣本庫行業的發展也在不斷的建設過程中，較為成功的如復旦大學附屬腫瘤醫院組織庫、北京協和醫院臨床生物標本中心、第四軍醫大學附屬西京醫院生物樣本庫等專科樣本庫都有長足的發展，為專科樣本庫的建設積累了經驗[10-11]。

但隨著專科生物樣本庫的快速發展，問題也越來越凸顯，主要存在以下問題：①規模小，同一家醫院可能存在多個小型的科室樣本庫或課題樣本庫；②腫瘤專科樣本庫在取材、存儲、出庫等過程不同于其他類型的樣本庫，但是缺少統一的標準；③腫瘤專科樣本庫依托于本院臨床資源，在樣本數量上相比于綜合醫院處于劣勢，樣本的存儲和使用周轉率較小。

2 上海交通大學附屬胸科醫院生物樣本庫建設

2.1 樣本庫的組織構建和管理 規范的生物樣本庫建設需要完善的組織構架來實現。我院由分管科研的院領導牽頭頂層設計、科教部統籌協調、生物樣本庫管理委員會監管和審批，并配備專業、專職的工作人員，負責生物樣本庫的建設和日常運行及管理。將醫院原本的較為小型的科室樣本庫、課題樣本庫等收歸生物樣本庫統一管理，每一份樣本從收集到使用再到結果的反饋，都有清晰的記錄，保證了樣本的可追溯性，避免了生物樣本資源管理的混亂。

2.2 知情同意書的簽署 生物樣本采集知情同意書，由醫院倫理委員會審批通過。知情同意書放置于電子病歷中，在收集樣本之前，由醫生與患者溝通得到同意后簽署，若患者有疑問，由臨床醫生與生物樣本庫工作人員做進一步的解釋，爭取患者的同意。

2.3 血液樣本的采集和處理 臨床上血液樣本的采集，由醫生開具醫囑，護士執行醫囑采集血液。采集的血液樣本及時送到生物樣本庫，樣本庫工作人員盡快將血液樣本低溫離心并分裝，3 000 rpm×10 min，分裝成血漿、血沉棕黃層、紅細胞和血清，每份0.5 mL，分裝完成后貼標簽立刻入庫，-80 ℃保存。短時間不能完成離心處理的血液樣本，于4 ℃保存，最長時間不超過4 h。

2.4 組織樣本的采集和處理 組織樣本的采集在病理科取材室進行，在病理醫生做完術中病理并出具冰凍診斷報告后盡快取材。通常取腫瘤組織和配對的癌旁/正常組織，并且分裝成小份保存，便于樣本以后直接出庫，避免反復凍融生物樣本(圖1)。所有樣本的取材必須保證不能影響正常的病理診斷及后續治療，并且樣本庫為每個捐獻者留取一份副本，以保證不會因為隨著生物樣本的出庫造成該樣本資源的耗竭。

圖1 組織樣本的采集

考慮到組織內大分子結構的不穩定性，樣本從手術離體到入庫，時間控制在15 min以內，最長不超過30 min。并且將入庫時間作為樣本信息，記錄在生物樣本庫管理系統中，作為生物樣本的一個重要信息保存。

采集生物樣本有2種模式：①課題導向的生物樣本收集，臨床科研人員根據自身的課題需求，向生物樣本庫提出申請，收集某種特定的生物樣本，例如放化療后的胸腺癌、食管癌生物樣本；②以肺癌為主的胸部腫瘤樣本收集，包括肺癌(含少見腫瘤)、食管癌、縱隔腫瘤、心房粘液瘤、心瓣膜組織等，這種生物樣本收集方式不具體滿足某一課題要求，僅僅根據我院的專科特色進行收集，以滿足大多數臨床科研人員的研究需求。

生物樣本的保存方式多種多樣，冷凍、RNAlater、蠟塊等方式，可根據自身單位的實際情況及課題的要求，選擇合適的保存方式。我院生物樣本庫采用冷凍及RNAlater保存方式，生物樣本取材后經液氮快速冷凍，防止細胞內形成的冰晶損壞細胞結構或活性分子的結構，然后轉移到低溫存儲設備中。液氮快速冷凍時間不宜過長，否則液氮的低溫會使得凍存管密封圈失去效果，導致液氮進入凍存管，一方面會導致樣本的交叉污染，另一方面在樣本出庫的過程中，凍存管內的液氮迅速膨脹，極易發生爆管，造成傷害。另外，我院生物樣本庫也采用氣相液氮的保存方式，大型氣相液氮罐配備后備液氮供應系統，能夠使得氣相液氮罐中一直處于氣相狀態，其溫度達到-190 ℃，既保證了樣本的低溫存儲，也很好的解決了液氮可能進入凍存管的問題。另外，RNAlater能夠很好的保存組織RNA，向凍存管內注入10倍于組織體積的RNAlater，-20 ℃保存。

我院生物樣本庫依托于豐富的臨床資源，是以胸部腫瘤為特色的生物樣本庫，現已收集樣本數量愈84 000份，捐獻者接近10 000例，并且隨著捐獻者數量和生物樣本數量的不斷增加，收集的生物樣本病種類型還在不斷的增加(圖2)。

圖2 生物樣本庫捐獻者數量和病種數量

2.5 生物樣本的質量控制 生物樣本的質量是樣本庫工作的核心，樣本應在規范、嚴格的條件下進行采集、處理、保存、運輸及出庫，影響生物樣本質量的因素包括分析前變量和分析變量。分析前變量包括生物變異、樣本收集、處理和存儲等過程[12-15]，對生物樣本質量影響較大。

2016年，由復旦大學附屬腫瘤醫院組織庫牽頭，上海交通大學附屬胸科醫院生物樣本庫參與編寫了《惡性腫瘤生物樣本庫標準操作流程》，將本院生物樣本庫實踐經驗共享的同時，也吸收其他腫瘤專科樣本庫的經驗。參與翻譯《加拿大組織庫協作網絡標準操作流程》，借鑒國際上成功樣本庫的經驗，建設好本院的生物樣本庫。

2.5.1 組織樣本的病理評價 組織樣本在入庫前或者入庫后短時間內，需要對樣本的病理狀況進行評估，包括樣本的腫瘤細胞比例、腫瘤分級以及病理診斷等，必要時將樣本采集單位的病理報告和病理切片圖像資料等作為生物樣本信息錄入樣本庫信息管理系統。

2.5.2 總體分子水平評價 生物樣本庫的質量評價一般針對總體分子水平的評價，RNA相對于DNA更容易發生破壞和降解，所以通常將RNA的完整性作為評價樣本的質量指標[10-11,13,15]。質量評價是一個長期的系統性工作，我們從建庫初期就建立了每月隨機抽檢制度，抽取一定比例(5%～10%)的庫存標本提取DNA/RNA(圖3)。同時我們還獲得由上海重大疾病臨床生物樣本庫質量控制中心、上海醫藥臨床研究中心、上海生物樣本庫工程技術研究中心聯合頒發的質控證書。

圖3 抽樣質控樣本RNA質量檢測結果

2.5.3 生物樣本質量信息反饋 生物樣本庫一個重要的工作是為研究人員提供質量合格的生物樣本，并且提供生物樣本相關信息，而研究人員對生物樣本的使用過程也是對樣本質量進行進一步檢測的過程，研究者將樣本使用過程中的質量信息反饋給生物樣本庫，這對于生物樣本庫評估樣本質量信息、改進樣本采集處理、存儲過程、冷鏈運輸等多個環節均有重要意義。質量控制體系也可根據研究人員的信息反饋進行適當的優化，從而更加全面、有效地反映生物樣本庫存儲樣本的質量信息。

2.6 生物樣本信息化建設 生物樣本庫的核心建設是數據庫建設，因此，全面又準確地錄入與生物樣本的關聯數據是信息管理系統的重要組成部分[16-17]，以便對樣本進行注釋，包括實體腫瘤的大小、種類、數量、原發位置、冷缺血時間、入庫時間等，捐獻者基本信息、檢驗信息、病理信息、影像資料等，捐獻者的術后治療、術后用藥和復發情況等隨訪信息。

生物樣本庫建設之初，我們是由人工將樣本信息錄入信息管理系統，但隨著生物樣本的入庫和出庫量逐漸增多，人工錄入既耗時耗力又易出錯。目前我們采用間接信息對接的方式，即在病歷系統和樣本庫信息管理系統之間建立一個數據平臺，通過特定字段讀取自動錄入所需的與生物樣本關聯的結構化信息，不僅實現了信息錄入的自動化操作，又避免了接口的直接對接可能產生的風險。

2.7 生物樣本的使用與共享 每一份使用生物樣本的申請，必須是經過倫理委員會審核且在科教部備案的科研項目。通過院內協同辦公平臺提交給生物樣本庫審核，是否有適合申請者所需的生物樣本，隨后轉發給科教部及分管院長審批，規范的申請和審批流程保證每一份出庫的生物樣本都有據可查。腫瘤專科生物樣本庫在數量上無法比擬綜合醫院生物樣本庫，故收集的樣本要能使用起來，才能真正體現生物樣本庫的價值所在，我院所有生物樣本的申請均免費使用，保證院內每一個想做科研能做科研的人員能夠用得上樣本庫的每一份樣本。 真正實現了生物樣本的共享、服務于醫院的臨床醫學研究事業。

同時，依托于上海市科學技術委員會-上海市專業技術服務平臺項目“常見惡性腫瘤生物樣本庫網絡建設”項目，與上海復旦大學附屬腫瘤醫院及滬上其他8家三級甲等醫院共同建立了“上海市惡性腫瘤生物樣本庫網絡系統”，目前已共享2 000例肺癌生物樣本。利用“互聯網+樣本庫”，形成具有檢索、臨床病理診斷、藥物治療、檢驗、影像、樣本存儲、樣本服務、網絡協同辦公及冷鏈物流等信息的一站式惡性腫瘤生物樣本庫專業技術服務平臺。

3 結語與展望

上海交通大學附屬胸科醫院生物樣本庫中收集的每一份生物樣本均遵照標準操作規程、質量合格、信息完整，以保證每一份生物樣本都具有科研價值；通過規范的網絡申請及審批流程、內部質量控制體系和定期的評估機制，生物樣本的使用和共享得以真正實現，才能充分發揮生物樣本資源的價值，生物樣本庫也因此充滿活力，在臨床科研工作中發揮重要的支撐作用。