應用CRISPRi技術敲低恥垢分枝桿菌異檸檬酸脫氫酶基因

周鳳竹，胡亞文，葛文雪，張雪蓮

復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室， 上海 200433

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，ICD)是三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TAC)循環(huán)中的關鍵酶，在輔酶存在時調節(jié)D-異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸和二氧化碳。該限速步驟是TCA循環(huán)中第1個生成NADPH的反應。結核分枝桿菌H37Rv菌株編碼兩種ICD，分別為ICD1和ICD2[1]。牛分枝桿菌卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株編碼與H37Rv完全同源的ICD1和ICD2。利用工程菌表達的重組ICD1和ICD2在體外均有生物學功能[3]，但它們對輔酶NADP的親和力不同，Km(NADP)值及pH耐受性和熱穩(wěn)定性也有所不同[2]。在BCG菌體中敲除icd2無法檢出ICD酶活，同時敲除株產(chǎn)生表型缺陷，需在培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺才能正常生長，敲除icd1則對ICD酶活基本無影響，表明ICD2是BCG中負責碳通量進入TAC的關鍵酶，但ICD1的生理作用尚不清楚[4]。同時，由于敲除結核分枝桿菌中icd2的研究均沒有成功，推測icd2可能是結核分枝桿菌生長的必需基因[5]。與BCG和結核分枝桿菌不同，恥垢分枝桿菌只編碼1種ICD——MsICD，與結核分枝桿菌中ICD2高度同源，編碼基因MSMEG_1654為恥垢分枝桿菌生長的必需基因[4]。

恥垢分枝桿菌由于生長較快，又同屬分枝桿菌屬，常被用來研究分枝桿菌的生理及代謝功能。由于分枝桿菌體內重組率非常低，其基因敲除一直是個難題。迄今雖然發(fā)展出許多方法來提高結核分枝桿菌的重組效率，如高滴度噬菌體特異性轉導[6]、溫敏型重組質粒介導的同源重組[7]等，但無法實現(xiàn)對必需基因的敲除。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列干擾(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference，CRISPRi)技術是一種基于Cas9的調控基因表達的技術，其中Cas9是來自Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的RNA介導的DNA內切核酸酶[8]。……